蛻皮激素誘導(dǎo)的絲腺相關(guān)基因表達(dá)研究.pdf

1、在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中一般采用各種不同的管家基因作為內(nèi)源參照基因?qū)δ康幕蜻M(jìn)行校正，以消除不同樣本在RNA產(chǎn)量、質(zhì)量以及逆轉(zhuǎn)錄效率上可能存在的差別。理想的內(nèi)參基因應(yīng)在各種實(shí)驗(yàn)因素條件下，各種類型的組織或細(xì)胞中均恒定表達(dá)。然而，大量的研究結(jié)果表明，內(nèi)參基因的表達(dá)并不穩(wěn)定，如果沒有合適的標(biāo)準(zhǔn)化處理，盲目地使用某一管家基因作為內(nèi)參，可能導(dǎo)致錯(cuò)誤甚至相反的結(jié)論。
　　本文按照MIQE規(guī)則檢測了家蠶7種常用內(nèi)參基因(Actin3、GAPDH

2、、28SrRNA、RPL3、α-Tubulin、UBC和TBP)正常條件下的不同發(fā)育時(shí)期及蛻皮激素誘導(dǎo)條件下在不同組織的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平,并利用標(biāo)準(zhǔn)化分析軟件geNorm和NormFinder進(jìn)行穩(wěn)定性分析，找到了不同實(shí)驗(yàn)條件下在不同組織中相對穩(wěn)定表達(dá)的基因。利用篩選出的內(nèi)參基因檢測了Fib-H，F(xiàn)ib-L，F(xiàn)mbp-1和SGF-1基因在家蠶后部絲腺，P25，Ser-1，SGF-1和Fmbp-1基因在中部絲腺，F(xiàn)ib-H，F(xiàn)ib-L，SGF

3、-1和Fmbp-1基因在脂肪體組織中的轉(zhuǎn)錄水平變化，通過比較組織間的轉(zhuǎn)錄水平，分析蠶體組織以及Fib-H、Fib-L、P25、Ser-1、SGF-1、Fmbp-1基因在蛻皮激素誘導(dǎo)后的表達(dá)調(diào)控特征。研究結(jié)果如下：
　　1.正常條件下內(nèi)參基因的穩(wěn)定性
　　采用RT-PCR檢測了7種內(nèi)參基因在家蠶五齡第一天至第七天的表達(dá)水平，然后使用內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析軟件geNorm和NormFinder對內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行評估。軟件分析結(jié)果

4、顯示在不同組織中相對穩(wěn)定的基因是不同的，其中α-Tubulin、GAPDH在中部絲腺，GAPDH、UBC在后部絲腺，α-Tubulin、UBC在脂肪體組織中表達(dá)相對較為穩(wěn)定。
　　2.蛻皮激素誘導(dǎo)刺激條件下內(nèi)參基因的穩(wěn)定性
　　使用geNorm和NormFinder軟件分別對候選的7種內(nèi)參基因在20E誘導(dǎo)條件下五齡第2天0至72 h的表達(dá)水平進(jìn)行評估。其中內(nèi)參基因α-Tubulin、28SrRNA在中部絲腺，GAPDH和28

5、SrRNA在后部絲腺，α-Tubulin和UBC在脂肪體中的表達(dá)相對穩(wěn)定。
　　3.蛻皮激素誘導(dǎo)后Fib-H、Fib-L、P25、Ser-1、SGF-1和Fmbp-1基因的組織轉(zhuǎn)錄水平分析
　　蛻皮激素誘導(dǎo)后Fib-H，F(xiàn)ib-L，P25，Ser-1基因在后部絲腺、中部絲腺中的表達(dá)量都有不同程度的降低，表明家蠶五齡幼蟲早期階段外源添食蛻皮激素對于Fib-H，F(xiàn)ib-L，P25和Ser-1基因表達(dá)有一定抑制作用。SGF-1和F

6、mbp-1基因在蛻皮激素誘導(dǎo)后在后部絲腺、中部絲腺中的表達(dá)量分別在不同的時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)了升高，表明蛻皮激素可以促進(jìn)SGF-1和Fmbp-1基因的表達(dá)。絲蛋白基因的表達(dá)有眾多的調(diào)控因子，關(guān)于表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)還有待于進(jìn)一步研究。
　　本研究按照MIQE規(guī)則對家蠶常用的七種內(nèi)參基因在正常條件下的不同發(fā)育時(shí)期及蛻皮激素誘導(dǎo)條件下在不同組織中的穩(wěn)定性進(jìn)行分析，研究發(fā)現(xiàn)，在不同實(shí)驗(yàn)條件下，不同組織中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是不同的。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR