硫酸黏菌素致小鼠神經(jīng)毒性初探及其毒代動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、黏菌素是多黏芽孢桿菌培養(yǎng)液中獲得的堿性環(huán)狀多肽類抗生素，治療多重耐藥革蘭氏陰性菌感染的有效藥物，但因其具有神經(jīng)毒性和腎毒性使黏菌素的應(yīng)用受到極大限制。近年來(lái)多重耐藥革蘭氏陰性“超級(jí)細(xì)菌”的出現(xiàn)，使黏菌素越來(lái)越受到世界各國(guó)學(xué)者的關(guān)注，其臨床應(yīng)用價(jià)值得到重新認(rèn)識(shí)和再評(píng)價(jià)，所以明確其毒性作用機(jī)制對(duì)探尋新的減毒措施具有重要的指導(dǎo)意義。本試驗(yàn)選用小鼠作為試驗(yàn)動(dòng)物，從體外和體內(nèi)兩方面對(duì)硫酸黏菌素的神經(jīng)毒性進(jìn)行研究，并初步探討其神經(jīng)毒性發(fā)生的可能機(jī)制

2、。
　　 選用18～22g昆明小鼠進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，測(cè)定靜脈注射硫酸黏菌素的半數(shù)致死量；在毒代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)中，將60只昆明小鼠以最大耐受量尾靜脈注射硫酸黏菌素，分別在給藥后0.17、0.33、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、12和24h麻醉處死6只小鼠，分離血漿和組織，UPLC/MS/MS法測(cè)定血漿和組織中硫酸黏菌素的濃度；另取18只小鼠，測(cè)定給藥后1h和24h的血液生化指標(biāo)。亞急性試驗(yàn)中，選用48只昆明小鼠，隨機(jī)

3、分為空白對(duì)照組及硫酸黏菌素低、中、高劑量給藥組，每組12只，給藥組以2.5、5.0、7.5mg·kg-1劑量連續(xù)靜脈給予硫酸黏菌素7d，空白對(duì)照組注射生理鹽水。觀察臨床癥狀，末次給藥后24h，處死小鼠，檢測(cè)血清、腦、脊髓組織中N-乙?；窠?jīng)氨酸含量和乙酰膽堿酯酶活性；另選擇昆明小鼠48只，以2.5、5.0和7.5mg·kg-1劑量尾靜脈注射硫酸黏菌素，對(duì)照組每天注射生理鹽水，連續(xù)注射7d；在給藥前和給藥后第1、3、7、14d，進(jìn)行神經(jīng)行

4、為學(xué)測(cè)試(步態(tài)、網(wǎng)格指數(shù)和熱覺傳導(dǎo)速率試驗(yàn))。以上毒性作用試驗(yàn)結(jié)果表明：
　　 (1)小鼠靜脈注射硫酸黏菌素的半數(shù)致死量為12.5mg·kg-1，可見其注射途徑給藥毒性較高，注射后出現(xiàn)明顯的毒性癥狀。
　　 (2)毒代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)中，建立了血漿和組織中硫酸黏菌素含量測(cè)定的超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法；靜脈給予最大耐受量硫酸黏菌素后，小鼠身上可呈現(xiàn)硫酸黏菌素在臨床中出現(xiàn)的肌肉無(wú)力、共濟(jì)失調(diào)、呼吸困難、呼吸衰竭等毒性癥狀，說(shuō)明小鼠對(duì)硫

5、酸黏菌素的潛在毒性具有敏感性，可以用來(lái)作為硫酸黏菌素毒性試驗(yàn)動(dòng)物模型；血漿毒代動(dòng)力學(xué)結(jié)果表明硫酸黏菌素易分布到各組織中，其中血漿AUC0-∞為25.5μg·h·mL-1；t1/2λZ為9.8h；表觀分布容積為5.5L·kg-1；組織毒代動(dòng)力學(xué)顯示硫酸黏菌素在腦組織中半衰期最長(zhǎng)，在腎組織中暴露水平最高，表明腦組織是其蓄積的主要器官，腎組織是其毒性作用的主要靶器官。
　　 (3)在亞急性毒性試驗(yàn)中，硫酸黏菌素中劑量組(5mg·kg-

6、1)和高劑量組(7.5mg·kg-1)能夠顯著增加小鼠血清中N-乙?；窠?jīng)氨酸含量以及腦和血清中乙酰膽堿酯酶活性，降低小鼠腦和脊髓組織中N-乙?；窠?jīng)氨酸含量；神經(jīng)行為學(xué)測(cè)試，高劑量組硫酸黏菌素可使小鼠出現(xiàn)行為學(xué)變化。提示硫酸黏菌素能引起腦、脊髓神經(jīng)元損傷和凋亡，影響小鼠的運(yùn)動(dòng)和感覺神經(jīng)功能。
　　 以原代培養(yǎng)的小鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元為研究對(duì)象，在含終濃度硫酸黏菌素為0、62.5、125、250和500μg·mL-1的D

7、MEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h后，從細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、生化角度、DNA斷裂變化、氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)外游離Ca2+濃度等方面，探討硫酸黏菌素對(duì)小鼠DRG神經(jīng)元的毒性機(jī)制。試驗(yàn)結(jié)果表明：
　　 (1)形態(tài)學(xué)觀察、AO/EB雙熒光染色、Hoechst33258染色、DNA Ladder檢測(cè)、Caspase-3活性變化等結(jié)果顯示，硫酸黏菌素125μg·mL-1劑量組可導(dǎo)致DRG神經(jīng)元病變，但無(wú)明顯細(xì)胞凋亡變化；250μg·mL-1和500

8、μg'mL-1劑量組硫酸黏菌素可導(dǎo)致小鼠DRG神經(jīng)元發(fā)生病變和凋亡，且病變和凋亡程度具有劑量依賴性，說(shuō)明硫酸黏菌素對(duì)小鼠DRG神經(jīng)元有毒性作用。
　　 (2)隨著硫酸黏菌素濃度的增加，小鼠DRG神經(jīng)元中ROS活性升高，GSH含量降低，打破細(xì)胞的氧化還原平衡，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，致使DRG神經(jīng)元氧化損傷，揭示氧化應(yīng)激可能是硫酸黏菌素的神經(jīng)毒性機(jī)制之一。
　　 (3)隨著硫酸黏菌素濃度的增加，小鼠DRG神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)液中乙酰膽堿含

9、量降低。提示硫酸黏菌素可使神經(jīng)元突觸末梢釋放乙酰膽堿的量減少。
　　 (4)隨著硫酸黏菌素濃度的增加，小鼠DRG神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i濃度升高，細(xì)胞培養(yǎng)液中[Ca2+]i濃度降低，提示細(xì)胞內(nèi)外[Ca2+]i濃度變化可能是硫酸黏菌素導(dǎo)致DRG神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制之一。
　　 綜上所述，硫酸黏菌素在體內(nèi)外均能夠引起小鼠神經(jīng)元形態(tài)改變，神經(jīng)元氧化應(yīng)激，通過Ca2+等途徑誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，造成神經(jīng)系統(tǒng)損傷，引發(fā)其神經(jīng)毒