霉酚酸在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)及其胃腸道毒性機(jī)制研究.pdf

1、霉酚酸(MPA)是器官移植臨床的一線用藥,越來越多的器官移植患者使用該藥來對抗排斥反應(yīng),但常有患者因嚴(yán)重的胃腸道不良反應(yīng)而減量或停藥,這將會導(dǎo)致患者排斥反應(yīng)發(fā)生率的增加。由于MPA的藥代動力學(xué)過程非常復(fù)雜,可受多種因素影響而出現(xiàn)較大的個體差異,其中需要長期合用的環(huán)孢素(CsA)就會對MPA的體內(nèi)過程產(chǎn)生較大的影響,從而影響其抗排斥反應(yīng)的療效發(fā)揮及毒性的增加,因此需要對其進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(TDM),調(diào)整MPA的用藥劑量以保證充足的療效及良

2、好的安全性,但由于不良反應(yīng)機(jī)制不清、可監(jiān)控性小等因為限制了其TDM的開展。本研究從MPA在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征及CsA的影響和胃腸道毒性的機(jī)制分析入手,擬為MPA的臨床合理用藥提供參考。主要研究內(nèi)容如下:
　　 1建立簡單、高效的HPLC-UV方法同時測定大鼠血漿及膽汁中MPA及其代謝物MPAG和AcMPAG的濃度。分別采用簡單高效的蛋白沉淀法和乙酸乙酯液-液萃取法提取血漿和膽汁中的三種待測物與內(nèi)標(biāo)。方法的專屬性、線性范圍、

3、日內(nèi)日間精密度、回收率和穩(wěn)定性均符合生物樣本的測定要求。
　　 2 MPA及其代謝物在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)和膽汁分泌特征及CsA的干預(yù)研究。大鼠口服給予MMF(MPA的前藥)后收集血樣至36h,膽汁樣品至9h,采用已建立的HPLC-UV方法檢測樣品中三種待測物的濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠血漿中只能測到MPA及其主要代謝產(chǎn)物MPAG,而未測到另一種活性代謝產(chǎn)物AcMPAG；膽汁中可測到包括AcMPAG的三種待測物。MPA與MPAG在大鼠血

4、漿的代謝特征均符合二室一級代謝動力學(xué)模型,MPA存在明顯的多峰現(xiàn)象。臨床對應(yīng)劑量(90mg/kg)的藥物口服后大鼠血漿MPA的主要藥代動力學(xué)參數(shù)(統(tǒng)計矩計算法)如下:T1/2z為12.9±8.2h,Cmax為35.5±12.1 mg/L,AUC0-36h為352.2±128.7 mg·h/mL,CLZ/F為0.20±0.07 L/h/kg,VZ/F為3.6±1.3 L/kg；9h內(nèi)三種待測物的膽汁排泄總量約占口服藥物總量的34.36％,

5、以MPA形式排泄的約0.08％,以MPAG和AcMPAG形式排泄的則分別為33.22％和1.06％。單用時不同劑量間的MPA-AUC0-36h及MPA-Cmax均呈良好的線性關(guān)系。合用CsA后這種線性關(guān)系受到影響,CsA能顯著升高正常劑量MMF組(45-90mg/kg)的MPA清除率、降低MPA-AUC(P<0.05),而高于正常劑量MMF組(180mg/kg)的MPA清除率及MPA-AUC均不受CsA影響(P>0.05),表明CsA對

6、MPA的藥代動力學(xué)影響可能是個非線性的過程。
　　 3采用NONMEM分析法建立MPA肝腸循環(huán)(EHC)的群體藥代動力學(xué)(PPK)模型,分析CsA對MPA藥代動力學(xué)個體差異的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MPA在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)特點與二房室模型擬合效果最好,另外還有一個EHC室,MPA自中央室排入EHC室的過程符合一級動力學(xué),而由EHC室回吸收至中央室的過程則符合零級動力學(xué),即為非線性過程。CsA與MPA清除率的個體間差異具有顯著相關(guān)性,將

7、CsA作為固定效應(yīng)引入模型可顯著降低模型的目標(biāo)函數(shù)值(P<0.001),改善模型的擬合效果。經(jīng)統(tǒng)計圖解分析、bootstrap抽樣法及濃度預(yù)測驗證,最終模型的預(yù)測效果準(zhǔn)確而穩(wěn)定。利用最終模型模進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合,發(fā)現(xiàn)EHC可使MPA-AUC降低約40％,而CsA則可使MPA-AUC降低約51％。結(jié)果表明MPA的EHC是一個非線性的過程,可顯著影響MPA的體內(nèi)暴露量；CsA可通過抑制MPA的EHC導(dǎo)致MPA-AUC出現(xiàn)非線性的變化,是造成MPA

8、藥代動力學(xué)個體間差異的一個重要影響因素。
　　 4連續(xù)服用MMF后大鼠的腸道反應(yīng)及細(xì)胞因子表達(dá)。連續(xù)口服給予大鼠40mg/kg的MMF,分為MMF1W、2W、3W組和對照組,觀察所致胃腸道反應(yīng),并用免疫組化方法檢測大鼠腸粘膜與腸炎相關(guān)的各種細(xì)胞因子的表達(dá)情況。結(jié)果顯示一周內(nèi)即可出現(xiàn)腹瀉、體重減輕等癥狀(與對照組相比,P<0.01或.P<0.05),持續(xù)一段時間后,隨著用藥時間的延長,這些癥狀會有所緩解(3W組出現(xiàn)體重增加,與1W

9、組相比,P<0.01)。腸道組織學(xué)檢查表明腹瀉期和非腹瀉期大鼠各腸段均可出現(xiàn)不同程度的炎癥性改變,包括淋巴細(xì)胞浸潤、腸細(xì)胞異型、腸粘膜及粘膜下層結(jié)構(gòu)破壞等。細(xì)胞因子的表達(dá)主要在腸粘膜固有層以上部位,表達(dá)升高比較明顯的細(xì)胞因子主要包括IL-1β、IL-6、IL-8(MMF1W、2W組與對照組相比,P<0.01或.P<0.05)和IL-10(所有MMF組與對照組相比,均為.P<0.01或P<0.05)。而對于一般慢性腸炎發(fā)生時常常升高的TN

10、F-α、IFN-γ和中性粒細(xì)胞標(biāo)記物MPO,本實驗的2W與3W組均未觀察到明顯的陽性表達(dá),只有1W組出現(xiàn)了IFN-γ和MPO的較高陽性表達(dá)(與對照組相比,P<0.05)。結(jié)果表明連續(xù)服用MMF可致大鼠發(fā)生腸道炎性改變,這種腸道反應(yīng)主要由免疫因素參與,可能與腸道局部某些細(xì)胞因子的表達(dá)升高有關(guān)。
　　 5霉酚酸及其代謝物對Caco-2細(xì)胞體外腸炎模型的作用研究。建立巨噬細(xì)胞RAW264.7與結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2的共培養(yǎng)系統(tǒng),將脂多

11、糖(LPS)加入底外層可引起RAW264.7細(xì)胞釋放大量的細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β(與對照組相比,P<0.001)及IL-6(與對照組相比,P<0.01),同時可測到共培養(yǎng)系統(tǒng)上層Caco-2細(xì)胞內(nèi)IL-8 mRNA的表達(dá)水平升高(與對照組相比,P<0.05)及Caco-2細(xì)胞上清液中乳酸脫氫酶(LDH)的升高(與對照組相比,P<0.001),表明本實驗所用細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)可成功模擬體外腸炎模型。分別以MPA、MPAG和AcMPAG

12、刺激底外層的RAW264.7細(xì)胞,觀察其細(xì)胞因子的分泌情況(IL-8的mRNA表達(dá))及共培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞損傷情況(LDH的分泌)。結(jié)果顯示MPA的活性代謝產(chǎn)物AcMPAG能夠刺激RAW264.7細(xì)胞大量分泌細(xì)胞因子IL-1β和IL-6(與對照組相比,P<0.01),5h內(nèi)可引起Caco-2細(xì)胞內(nèi)IL-8 mRNA的表達(dá)升高反應(yīng)(與對照組相比,P<0.05),48h內(nèi)可誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞的損傷,從而導(dǎo)致LDH的大量釋放(與對照組相

13、比,P<0.001)。而MPA與MPAG除了可引起LDH的釋放量輕度增加(與對照組相比,P<0.05)之外未表現(xiàn)有其他作用,而且LDH的釋放量顯著低于AcMPAG組(P<0.01)。另外AcMPAG與MPA可增加Caco-2細(xì)胞內(nèi)腸炎保護(hù)性物質(zhì)SERT的mRNA.表達(dá)。結(jié)果表明MPA的活性代謝產(chǎn)物AcMPAG能夠通過誘導(dǎo)一些細(xì)胞因子表達(dá)增加造成腸粘膜的炎癥性改變,可能是引起MPA腸道毒性的物質(zhì),誘導(dǎo)保護(hù)性物質(zhì)釋放可能是腸炎癥狀可自行緩解

14、的因為之一。
　　 結(jié)論:①本研究建立了一種簡單高效的同時測定MPA及其代謝產(chǎn)物MPAG與AcMPAG的HPLC-UV方法；②對MPA在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)及肝腸循環(huán)的特點進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,結(jié)果表明CsA可對MPA的體內(nèi)暴露量產(chǎn)生明顯的影響,提示臨床合用時可能影響MPA的臨床效果,可能需要實行MPA-TDM,為MPA的臨床合理用藥提供了一定的參考；③初步探明了MPA產(chǎn)生胃腸道毒性的機(jī)制可能是經(jīng)膽汁排入腸道的AcMPAG通過誘導(dǎo)某