豬偽狂犬病鑒別診斷研究與豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組序列的測(cè)定.pdf

1、偽狂犬病(Pseudorabies,PR)是由α皰疹病毒科的偽狂犬病病毒(PseudorabiesVirus,PrV)引起的包括多種家畜和野生動(dòng)物共患的一種烈性傳染病.豬 該病毒的天然宿主和貯存者.該病給中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失.預(yù)防、控制和最終根除該病是中國(guó)當(dāng)前面臨的一項(xiàng)艱巨任務(wù).在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家,偽狂犬病的根除計(jì)劃多采用gE或gG基因標(biāo)記疫苗和相應(yīng)的gE或gG鑒別診斷方法來進(jìn)行.gG糖蛋白是PrV的一種分泌蛋白,gE糖蛋白在決

2、定病毒的毒力及神經(jīng)嗜性等方面起著重要作用,但兩者都不是PrV增殖所必需的蛋白,因此可作為缺失的候選基因.目前中國(guó)已研制成功gE和gG基因標(biāo)記疫苗.為了建立適合中國(guó)國(guó)情的gE和gG鑒別診斷方法,開展了以下研究.1.PrVgG基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá).依據(jù)偽狂犬病病毒(Pseudorabies Virus PRV)Rice株序列,合成針對(duì)gG基因的特異性引物,從PRV鄂A株中擴(kuò)增出gG基因,并將其克隆到pBluescriptⅡSK+

3、質(zhì)粒中并測(cè)序,用SacI和HindⅢ酶切,將gG基因融合到pET-28a質(zhì)粒中T<,7>啟動(dòng)子下游,構(gòu)建成原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28A-gG<,1>,結(jié)果并未獲得表達(dá).2.gG-LAT和gG-ELISA的建立.以PRV gV基因表達(dá)提純產(chǎn)物為抗原分別致敏乳膠和包被酶標(biāo)板,摸索最佳的致敏和包被條件,建立了gG-LAT和gG-ELISA.3.PrVgE基因的主要抗原表位區(qū)在大腸桿菌中的表達(dá).將偽狂犬病毒(PRV)Ea株gE基因主要抗原表位區(qū)段

4、融合到原核表達(dá)載體pET28b的T7啟動(dòng)子下游,構(gòu)建成原核表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),SDS-PAGE和Westernblot印跡分析,證實(shí)gE基因主要抗原表位區(qū)在大腸桿菌中獲得了表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物具有抗原性,分子量為38kD,位于包涵體中.4.gE-LAT和gE-ELISA的建立.gE基因主要抗原表位區(qū)表達(dá)的包涵體蛋白經(jīng)變體、復(fù)性處理后,復(fù)性產(chǎn)物致敏乳膠,并對(duì)抗原致敏濃度、致敏時(shí)間、致敏溫度進(jìn)行優(yōu)化,建立了gE乳膠凝集試驗(yàn)(gE-LAT).