豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)和偽狂犬病ELISA抗體檢測方法及PRRSV弱毒活疫苗研究.pdf

1、華中農(nóng)業(yè)大學博士學位論文豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)和偽狂犬病ELISA抗體檢測方法及PRRSV弱毒活疫苗研究姓名：邱德新申請學位級別：博士專業(yè)：動物遺傳育種與繁殖指導教師：陳煥春熊遠著20031101中文摘要蛋白)克隆在ORF7編碼區(qū)下游；通過亞克隆構建了含ORF7和ORF6的重組原核表達質粒pGEX—KGNM，SDS—PAGE和Western—blot檢測證明：串連的ORF7、ORF6編碼的NM蛋白與GST實現(xiàn)了原核融合表達，表達

2、的融合蛋白GSTNM大小約60kDa且具有免疫學反應活性，也適合用于建立PRRS血清學診斷方法。4檢測PRRSV血清抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法的建立在原核表達的基礎上，通過方陣滴定，用提取的重組N蛋白(rN)和重組NM蛋白(rNM)分別建立了檢測PRRS血清抗體的rNELISA和rNMELISA，rNELISA和rNMELISA的抗原蛋白最佳包被濃度分別為498rtg／mL和44lag／mL，兩種方法的血清最適稀釋度均為l

3、：40，陰陽性判定的臨界值為O4，都表現(xiàn)出較好的敏感性、特異性和重復性，但檢測PRRSV抗體rNM—ELISA的建立在國內(nèi)外屬首次。將建立的rNELISA和rNMELISA分別與IDEXXELISA試劑盒進行比較檢測327份豬血清，結果rN—ELISA和rNMELISA的特異性差異不大，rNMELISA與IDEXXELISA試劑盒的陽性符合率相對較高(923％)，選擇rNM—ELISA作為制備PRRSV抗體檢測試劑盒的方法。在蛋白穩(wěn)定劑

4、作用下，所制備的PRRSV抗體檢測rNM—ELISA試劑盒在4℃和20℃保存穩(wěn)定期至少12個月，這為PRRSV抗體檢測提供了一種特異敏感、安全不散毒、保存期較長且適合我國國情的血清學診斷方法。5豬繁殖與呼吸綜合征弱毒活疫苗研究采用轉瓶生產(chǎn)技術，在MARC一145細胞中增殖PRRSV克隆20株，經(jīng)過條件的優(yōu)化選擇，確定增殖PRRSV的最佳條件為：在MARC一145細胞生長液中加入12％的NCS，用025％胰蛋白酶與002％EDTA以4：1

5、混合配制的細胞消化液消化細胞，每個轉瓶接種PRRSV量為810863TCIDso，接毒后72—96h收毒，可得到TCID50≥10655／01mL的高滴度PRRSV溶液，為生產(chǎn)疫苗打下基礎。PRRSV弱毒活疫苗對豬安全無致病性，疫苗的最小免疫劑量為106TCID50，能刺激豬產(chǎn)生特異性抗體應答，接種后14d可檢測出特異性中和抗體。疫苗內(nèi)的PRRSV滴度在凍于前后變化不大，凍干疫苗在4—8℃保存時有效期為6個月，20℃保存時有效期為18個