生物工程專業(yè)畢業(yè)論文

1、<p><b>　　1 引言</b></p><p>　　隨著各種生物活性短肽的不斷發(fā)現(xiàn)，其研究和開(kāi)發(fā)日益受到人們的關(guān)注。大量科學(xué)研究表明，通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)牡鞍酌杆獾鞍踪|(zhì)可以得到大量具有各種生物功能的多肽，這些多肽不僅具有較高的活性，而且來(lái)源廣泛、成本低、安全性好，制備操作簡(jiǎn)單、便于工業(yè)化生產(chǎn)，因此已成為科學(xué)研究的新熱點(diǎn)[1]。</p><p>　　小麥麩皮

2、是小麥加工的副產(chǎn)品，含有15% 以上的蛋白質(zhì)，是一種潛在的植物蛋白資源[2]。麥麩來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉。目前，我國(guó)麥麩的有效利用率很低，麥麩很少進(jìn)行深加工和再利用，經(jīng)濟(jì)價(jià)值不高，資源浪費(fèi)嚴(yán)重[3]，將麥麩蛋白酶解而得到生物活性肽不失為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)麥麩蛋白的途徑。</p><p>　　1.1 麥麩的營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)</p><p>　　1.1.1 膳食纖維的功能</p><p>

3、;　　小麥麩皮具有抗衰老、抗癌、減肥等重要生理功能，并且已被制成多種流行保健食品[,4,5]，小麥麩皮中起生理功能的最主要的成分是膳食纖維，約含40 %。許多資料表明，由非淀粉多糖組成的膳食纖維到達(dá)小腸后，通過(guò)減少在小腸的通過(guò)時(shí)間減少葡萄糖的吸收，減緩淀粉水解，對(duì)降低血膽固醇、糖尿病、高血脂、冠心病、高血壓均有良好的促進(jìn)作用。小麥麩皮還有減少憩室病、膽結(jié)石和結(jié)腸癌發(fā)生的重要作用[6]。膳食纖維還可顯著增加大鼠糞便正常細(xì)菌的含量。腸道中的

4、有益細(xì)菌能利用小麥麩膳食纖維產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸，如乙酸、丁酸等。這些脂肪酸能降低pH ，抑制腐生菌的生長(zhǎng)，減少致癌物質(zhì)的產(chǎn)生[7] 。</p><p>　　在制備小麥麩膳食纖維的過(guò)程中，通常采用酶解法除去淀粉、蛋白質(zhì)，這些酶解液中含有大量的糊精、低聚糖等水溶性物質(zhì)，可再加以利用。王衛(wèi)東等人將這些酶解液制成風(fēng)味獨(dú)特的麥香茶飲料[8]。利用膳食纖維具有的吸水、吸油、保水、保香等性質(zhì)，添加到豆醬、豆腐等食品及肉制品中，可

5、以保鮮和防止水的滲透；用于粉狀品時(shí)，可作為載體，制成沖劑；加入沙司、蛋黃醬中時(shí)可作為粘度調(diào)節(jié)劑；加入餅干食品中可使面團(tuán)易于成型；加入冰棍、糖果等食品，可用作防固結(jié)劑[9] 。</p><p>　　1.1.2 低聚糖的功能</p><p>　　麥麩中富含纖維素和半纖維素，是制備低聚糖的良好資源。小麥麩皮中的低聚糖具有系列生物活性[10]。首先，低聚糖具有良好的雙岐桿菌增殖效果，可作為雙歧桿菌

6、生長(zhǎng)因子應(yīng)用于食品。其次，低聚糖具有低熱值性能，屬難消化糖，不被口腔中的產(chǎn)酸類和其他微生物利用，顯示出抗齲齒功能。另外，由于它的低熱值性能，可以作為糖尿病、肥胖病、高血脂等病人理想的糖源。低聚糖還具有表面活性，可吸附腸道中有毒物質(zhì)及病原菌，提高機(jī)體抗病能力，激活免疫系統(tǒng)，用于醫(yī)藥工業(yè)和飼料工業(yè)。</p><p>　　1.1.3多肽作為蛋白質(zhì)組成的功能</p><p>　　小麥麩皮中含有14

7、.1%的蛋白質(zhì)，是十分豐富的植物蛋白質(zhì)資源。植物性來(lái)源的蛋白質(zhì)在膳食補(bǔ)充和食品加工中的地位越來(lái)越重要。它不僅可彌補(bǔ)膳食中蛋白質(zhì)的不足，減少對(duì)身體不利的飽和脂肪酸的攝入，還含有一些有生理活性的物質(zhì)，具有一些非常重要的功能特性。另外，麩皮蛋白質(zhì)還含有人體必需的多種氨基酸，甚至可與大豆蛋白相媲美[11]。</p><p>　　蛋白質(zhì)不是僅以氨基酸形式被吸收，而更多的是以肽的形式被吸收。組成有機(jī)生物體的20種氨基酸從空間

8、結(jié)構(gòu)上來(lái)說(shuō)比較簡(jiǎn)單，但以不同數(shù)目、不同種類的氨基酸結(jié)合形成肽就會(huì)產(chǎn)生空間結(jié)構(gòu)上較大的差異，這也是肽具有多種生物活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，正因?yàn)殡木哂卸喾N結(jié)構(gòu)，也就決定了它的多種特殊生理功能。麥麩肽具有人體代謝和生理調(diào)節(jié)功能，易消化吸收，有促進(jìn)免疫、抗菌、抗毒、抗病等諸多作用，且食用安全性極高。</p><p>　　1.2 麥麩多肽的性質(zhì)</p><p>　　1.2.1麥麩多肽的溶解性</p&g

9、t;<p>　　麥麩多肽在不同的pH值范圍內(nèi)，其溶解度基本上沒(méi)有變化，說(shuō)明麥麩肽的溶解性不受pH值的影響，具有良好的溶解性[12]。當(dāng)?shù)鞍妆幻附夂螅鞍踪|(zhì)多聚體解離為小分子的肽，分子由卷曲狀態(tài)成為較伸展的狀態(tài)，增加了分子表面電荷，加強(qiáng)了分子與分子之間、分子與水溶液之間的靜電作用。因此，麥麩多肽的溶解性不受pH值影響。</p><p>　　1.2.2 麥麩多肽的穩(wěn)定性</p><p

10、>　　在pH6.0～8.0 范圍內(nèi)麥麩多肽比較穩(wěn)定，pH<4.0 及pH>8.0 時(shí)，麥麩多肽的穩(wěn)定性下降。隨著加熱溫度的升高麥麩多肽的穩(wěn)定性下降的幅度也增大，在60℃以下的加熱溫度下，其較為穩(wěn)定。丙三醇、蔗糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖對(duì)麥麩多肽的熱變性有明顯的保護(hù)作用，其中丙三醇的保護(hù)效果最好。由于它的加入使麥麩多肽在60℃的條件下加熱30 min 后，抗氧化性提高了34.31%。保護(hù)劑的濃度為40%時(shí)，較為適宜。<

11、;/p><p>　　1.2.3麥麩多肽的安全性</p><p>　　麥麩多肽小鼠急性毒性試驗(yàn)，LD50 ＞ 20g/kg，屬無(wú)毒級(jí)。Ames 試驗(yàn)、骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、睪丸精母細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)、彗星試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。表明麥麩多肽是一種無(wú)毒物質(zhì)，毒性試驗(yàn)結(jié)果初步證明麥麩多肽作為保健食品是安全的。</p><p>　　1.3 麥麩多肽的制備</p><p

12、>　　1.3.1 酶法制備</p><p>　　以麥麩蛋白為原料，用堿性蛋白酶Alcalase 水解麥麩蛋白制備麥麩多肽。劉長(zhǎng)江等人采用酶法制備麥麩多肽， 研究了溫度、pH 值、酶用量、及水解時(shí)間對(duì)麥麩多肽制備率的影響，找出提取的最佳工藝參數(shù)。確定采用堿性蛋白酶Alcalase制備麥麩抗氧化肽的最佳酶解條件為：[E]/[S]=5%、pH8.0、溫度50℃、時(shí)間3 h。</p><p>

13、;　　1.3.2 啤酒麥糟制備</p><p>　　該方法是將濕啤酒糟進(jìn)行干燥、粉碎和過(guò)篩，得到啤酒糟；加入麥麩多肽，室溫下攪拌，過(guò)濾去渣，離心，得到蛋白提取液；調(diào)節(jié)pH4.0~5.0進(jìn)行沉淀，去上清液，真空冷凍干燥，得到粗多肽；在啤酒糟粗蛋白中加入磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH6.5~8.5；加入Alcalase堿性蛋白酶，加熱至45℃~65℃，在攪拌條件下水解1h~5h；水解完畢之后，于沸水浴滅酶，離心

14、；取離心后的上清液用凝膠柱分離，分別收集各峰后濃縮，冷凍干燥，得到活性麥麩多肽。</p><p>　　1.3.3 酸堿法制備</p><p>　　用化學(xué)強(qiáng)酸或強(qiáng)堿催化麥麩蛋白質(zhì)獲得麥麩多肽，但是此法投資大、占地多、工藝復(fù)雜、污染大、分子量難以控制，產(chǎn)品有化學(xué)殘留，難以形成功能，很難實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，至今仍停留在實(shí)驗(yàn)室。</p><p>　　1.4 麥麩多肽的抗氧化性研

15、究</p><p>　　1.4.1 麥麩多肽清除自由基能力</p><p>　　人體自由基應(yīng)處于平衡中，如果自由基過(guò)多或者清除過(guò)少，就會(huì)對(duì)組織產(chǎn)生傷害。麥麩蛋白中蘊(yùn)涵著許多具有生物活性的氨基酸序列，用特異的蛋白酶水解就有可能釋放出有活性的麥麩多肽。麥麩蛋白抗氧化性肽能抑制機(jī)體內(nèi)自由基的大量積累，對(duì)提高自由基清除機(jī)制起到一定的功效，從而能在一定程度上消除機(jī)體內(nèi)多種生理功能的障礙，延緩機(jī)體的衰

16、老，減少各種老年性疾病的發(fā)生[13]。</p><p>　　1.4.2 麥麩多肽對(duì)H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血的抑制作用</p><p>　　紅細(xì)胞中加入H2O2后，紅細(xì)胞膜氧化受損，導(dǎo)致溶血現(xiàn)象。純化后的麥麩多肽可明顯抑制氧化溶血現(xiàn)象的發(fā)生。麥麩多肽對(duì)H2O2 誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化溶血實(shí)驗(yàn)[15]表明麥麩多肽對(duì)H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化溶血的抑制作用在3個(gè)濃度水平上(15 mg/mL、30 mg/

17、mL、60mg/mL)均達(dá)到了顯著水平(P＜0.01)，且表現(xiàn)出一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。說(shuō)明麥麩多肽能明顯抑制溶血反應(yīng)的發(fā)生，有效保護(hù)紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性。</p><p>　　1.5 麥麩多肽前景展望</p><p>　　迄今為止，我國(guó)對(duì)麥麩的綜合利用的總體水平處在初級(jí)開(kāi)發(fā)階段，尚未能躍上一個(gè)新臺(tái)階，寶貴的麥麩資源未能得到充分、合理、有效的利用。鑒于麩皮含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)、粗纖維等，對(duì)麥

18、麩進(jìn)行深加工，提取其中的有效成分，研究開(kāi)發(fā)一些高附加值的麩皮產(chǎn)品，突破其單一的用途，將產(chǎn)生很高的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。因此酶解麥麩蛋白不失為國(guó)內(nèi)麥麩蛋白資源開(kāi)發(fā)利用的重要途徑之一，經(jīng)SephadexG-25、DEAE-32 纖維素純化后的麥麩多肽能減少紅細(xì)胞溶血，減輕肝臟線粒體膨脹程度，說(shuō)明麥麩多肽具有較強(qiáng)的抗氧化功能。可見(jiàn)，麥麩多肽具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。通過(guò)本研究，為麥麩多肽的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和工藝參數(shù)，從而為使麥麩多肽更加廣泛的應(yīng)

19、用于保健品和功能食品領(lǐng)域提供理論基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但其體內(nèi)抗氧化活性和抗氧化作用機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。</p><p>　　1.6 課題研究的目的和主要內(nèi)容</p><p>　　近年來(lái)已有研究證實(shí)，在胃腸中肽比氨基酸更易被機(jī)體吸收利用。人體可能主要是以肽的形式來(lái)吸收氨基酸[15]。目前已發(fā)現(xiàn)許多具有特殊生理功能的食品蛋白源多肽，如抗氧化肽、降血壓肽、降血脂肽、降膽固醇肽、抗菌活性肽、免疫調(diào)節(jié)

20、肽等。麥麩蛋白來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，從麥麩蛋白的酶解產(chǎn)物中能夠分離出多種具有生理功能的多肽、。麥麩多肽是一種非常優(yōu)質(zhì)的功能性食品原料。</p><p>　　本研究以麥麩為原料，采用生物調(diào)控技術(shù)孵育麥麩，激活麥麩中內(nèi)源蛋白酶，以此降解麥麩蛋白，產(chǎn)生并富集多肽，并對(duì)麥麩多肽的抗氧化性進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)本研究，為麥麩多肽的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和工藝參數(shù)，從而為使麥麩多肽更加廣泛的應(yīng)用于

21、保健品和功能食品領(lǐng)域提供理論基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。</p><p><b>　　２ 材料和方法</b></p><p>　　2.1實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備</p><p><b>　　2.1.1 材料</b></p><p>　　麥麩：市售（在－20℃保藏備用）。</p><p>　　2.1

22、.2 實(shí)驗(yàn)試劑</p><p>　　2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備</p><p><b>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　2.2.1 麥麩處理方法</p><p>　　稱取2g麥麩置于離心管中，加入20mL的孵育液，于一定溫度下孵育一段時(shí)間后取出離心，測(cè)定上清液的多肽含量。</p><

23、;p>　　2.2.2 緩沖液種類和濃度對(duì)麥麩多肽富集的影響</p><p>　　在一定的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間下，采用醋酸緩沖液與檸檬酸緩沖液作為培養(yǎng)液，培養(yǎng)后進(jìn)行多肽含量的測(cè)定，得到最適于多肽富集的緩沖液。</p><p>　　將得到的最適緩沖液在相同的pH條件下，分別在緩沖液濃度為0.01 mol/L，0.05 mol/L，0.1 mol/L和0.2 mol/L下進(jìn)行多肽的測(cè)定，選取

24、適合麥麩多肽富集的最適緩沖液濃度。</p><p>　　2.2.3 麥麩多肽的富集工藝的單因素實(shí)驗(yàn)</p><p>　　以多肽含量為考察指標(biāo)，對(duì)孵育時(shí)間、孵育溫度、孵育液pH 值及液料比進(jìn)行單因素試驗(yàn)。</p><p>　　在pH3，液料比10：1，培養(yǎng)時(shí)間為6h的條件下，研究培養(yǎng)溫度對(duì)麥麩多肽富集的影響，設(shè)4個(gè)處理，培養(yǎng)溫度分別為45℃、50℃、55℃及60℃。&

25、lt;/p><p>　　在pH3，液料比10：1，培養(yǎng)溫度55℃的條件下，研究培養(yǎng)時(shí)間對(duì)麥麩多肽富集的影響，設(shè)4個(gè)處理，培養(yǎng)時(shí)間分別為2h、4h、6h及8h。</p><p>　　在液料比10：1，培養(yǎng)溫度55℃，培養(yǎng)時(shí)間為6h的條件下，研究培養(yǎng)液pH對(duì)麥麩多肽富集的影響，設(shè)4個(gè)處理，pH分別為3.0、4.0、5.0及6.0。</p><p>　　在pH3，培養(yǎng)溫度55

26、℃，培養(yǎng)時(shí)間為6h的條件下，研究液料比對(duì)麥麩多肽富集的影響，設(shè)4個(gè)液料比，分別為4:1、6:1、8:1、10:1(mL/g)</p><p>　　2.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化麥麩多肽培養(yǎng)條件</p><p>　　在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)液pH和料液比三個(gè)對(duì)麥麩多肽富集效果影響顯著的因素，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，確定最適的培養(yǎng)條件。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。</

27、p><p><b>　　表1 因素水平表</b></p><p>　　采用Design-Expert 統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸和方差分析，優(yōu)化出最適條件組合。</p><p>　　2.2.5 多肽含量的測(cè)定</p><p>　　量取1mL 麥麩孵育液于10mL 離心管中，加入4mL PBS 緩沖液(pH7.0

28、、0.2mol/L)，靜置提取1h后10000r/min離心15min，上清液中加入等體積10g/100mL三氯乙酸(TCA)溶液，旋渦混合后靜置30min，10000r/min 離心15min 以沉淀大分子蛋白質(zhì)。取3mL的上清液，加入2mL的雙縮脲試劑，室溫放置10 min，再10000 r/min離心15 min，以還原型谷胱甘肽作為標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)測(cè)定上清液的A540來(lái)計(jì)算多肽含量[16]。</p><p>　

29、　2.2.6 多肽抗氧化性的測(cè)定</p><p>　　2.2.6.1麥麩多肽預(yù)處理</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面優(yōu)化組的方案孵育麥麩，用得到的麥麩多肽孵育液先經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮到一定體積，再進(jìn)行冷凍干燥，得到的多肽粉用無(wú)水乙醇配制成濃度分別為0.15g/mL，0.20 g/mL，0.25 g/mL，.0.30 g/mL，0.35 g/mL的醇提液做麥麩多肽的抗氧化性實(shí)驗(yàn)，并與相同濃度

30、的具有顯著抗氧化效果的Vc進(jìn)行比較。</p><p>　　2.2.6.2 清除羥自由基能力</p><p>　　取1 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液于試管中,依次加入0.2 mmol/L PBS 2 mL和蒸餾水1 mL,混勻后,加入0.75 mmol/L硫酸亞鐵水溶液1 mL,混勻后加入0.01 %過(guò)氧化氫水溶液1 mL,于37 ℃恒溫水浴中反應(yīng)60 min后,在536 nm

31、處快速測(cè)定其吸光值,所得數(shù)據(jù)為損傷管的吸光值（A損）,未損傷管以1 mL蒸餾水代替損傷管中1 mL 0.01%過(guò)氧化氫,操作方法同上,得未損傷管吸光值（A未）。樣品管以1 mL多肽醇提液代替損傷管中的1 mL蒸餾水,操作方法同上,得樣品管吸光值（A樣）。按下式計(jì)算樣品對(duì)羥自由基(·OH)的清除率：</p><p>　　·OH清除率（%）=(A樣－A損)/(A未－A損)×100。 &l

32、t;/p><p>　　2..2.6.3 清除DPPH·自由基活力</p><p>　　配制溶液濃度為1.0×10-4 mol/L DPPH·無(wú)水乙醇溶液,避光保存。取2mL麥麩多肽醇提液至2mL DPPH·溶液中,搖勻后靜置30 min,以無(wú)水乙醇作參比溶液,于517 nm處比色,該值為A1,同時(shí)測(cè)定2 mL無(wú)水乙醇與2 mL DPPH·溶液的

33、吸光值A(chǔ)2,2 mL醇提液與2 mL無(wú)水乙醇的吸光值為A0,按下式計(jì)算DPPH·自由基的抑制率：</p><p>　　抑制率（%）= [1－（A1－A0）/A2]×100</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1 緩沖液類型對(duì)麥麩多肽富集的影響</p><p>

34、;　　不同緩沖液對(duì)麥麩多肽含量的影響見(jiàn)圖1。兩種緩沖液對(duì)麥麩多肽的含量均呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后基本保持穩(wěn)定的趨勢(shì)。培養(yǎng)6h 時(shí)，檸檬酸緩沖液和醋酸緩沖液處理的麥麩所得到的多肽含量分別比孵育前增長(zhǎng)2.14和1.98倍。就兩種緩沖液而言，孵育時(shí)間小于4h時(shí)，兩種緩沖液孵育的麥麩中多肽含量沒(méi)有顯著差異(P<0.05)；在4h-8h之間兩者差異顯著，檸檬酸緩沖液培養(yǎng)的麥麩多肽含量高于醋酸緩沖液培養(yǎng)的。</p><p>　　從

35、圖1中也可以看出，兩種緩沖液孵育麥麩6h時(shí)的麥麩中多肽含量最大，這說(shuō)明，6 h是最適孵育時(shí)間。</p><p>　　3.2 緩沖液濃度對(duì)麥麩多肽富集的影響</p><p>　　檸檬酸緩沖液濃度對(duì)麥麩多肽富集的影響見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，檸檬酸緩沖液濃度為0.1 mol/L時(shí)，麥麩多肽含量最高。因此，本研究選擇0.1 mol/L檸檬酸緩沖液作為培養(yǎng)液。</p><p>

36、　　3.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果</p><p>　　3.3.1 培養(yǎng)溫度對(duì)麥麩多肽富集的影響</p><p>　　在pH3，液料比10：1，培養(yǎng)時(shí)間為6h的條件下，研究培養(yǎng)溫度對(duì)麥麩多肽富集的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，麥麩多肽的含量值逐漸增大，在55℃時(shí)達(dá)到最高值（35.7mg/g），隨后降低。</p><p>　　3.3.2 培養(yǎng)

37、液pH對(duì)麥麩多肽富集的影響</p><p>　　在培養(yǎng)時(shí)間6h，液料比10：1，培養(yǎng)溫度55℃的條件下，研究培養(yǎng)液pH對(duì)麥麩多肽富集的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，隨著pH值的升高，麥麩多肽的含量逐漸增加，在pH4時(shí)達(dá)到最高值32.7 mg/g，之后麥麩多肽含量緩慢降低，趨于平衡。</p><p>　　3.3.3培養(yǎng)時(shí)間對(duì)麥麩多肽富集的影響</p><p>

38、　　在液料比10：1，培養(yǎng)溫度55℃，pH3的條件下，研究培養(yǎng)時(shí)間對(duì)麥麩多肽富集的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，麥麩多肽的含量在2-4h間變化不大，4h后含量增加，6h時(shí)達(dá)到最高值27.2 mg/g，隨后下降。因此，培養(yǎng)6h是麥麩富集多肽的良好時(shí)間。</p><p>　　3.3.4液料比對(duì)麥麩多肽富集的影響</p><p>　　在pH3，培養(yǎng)溫度55℃，培養(yǎng)時(shí)間為6h的條件下，研究

39、液料比對(duì)麥麩多肽富集的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，隨著液料比的升高，麥麩多肽的含量先增加后減少，在液料比為8時(shí)達(dá)到最高值35.3(mg/g)。</p><p>　　3.4 響應(yīng)面優(yōu)化麥麩多肽富集條件的研究</p><p>　　3.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果</p><p>　　表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果表</p><p>　　響應(yīng)面試

40、驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2，所做的17組試驗(yàn)中所得到的麥麩多肽含量最大的條件是：培養(yǎng)溫度55℃、培養(yǎng)液pH 4.0、液料比8:1；得到的麥麩多肽含量最小的條件是：培養(yǎng)溫度50℃、培養(yǎng)液pH 3.0、液料比8:1。</p><p>　　3.4.2 回歸方程的建立及統(tǒng)計(jì)分析</p><p>　　用方差分析的F檢驗(yàn)對(duì)回歸模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果列于表3，相關(guān)系數(shù)R2（0.9868）與調(diào)整的相關(guān)系數(shù)Adj

41、-R2（0.9699）都接近1，說(shuō)明實(shí)際測(cè)定值與預(yù)測(cè)值之間有極高的擬合度。模型的F值為58.35，表明失擬概率低，顯著性分析得P<0.0001，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所得的回歸模型對(duì)麥麩多肽富集的量有很好的預(yù)測(cè)性。模型顯示X1X2，X1X3，X2X3極顯著（P﹤0.001），X1，X3，X12高度顯著（P﹤0.01），X2顯著（P﹤0.05）。</p><p>　　以麥麩多肽的含量為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，各因子對(duì)響應(yīng)值

42、的影響可用下面回歸方程表示：</p><p>　　Y=-594.76779+11.94048X1+35.54110X2+55.56511X3-0.21403X1X2+ 0.095120X1X3-0.11892X2X3-0.10606 X12-2.77051X22-3.72176X32</p><p>　　表3 回歸方程各項(xiàng)方差分析</p><p>　　R2=0.98

43、68 Adj-R2=0.9699 Pred R2=0.8251 Adeq Precision=19.353</p><p>　　注：***，差異極顯著（P﹤0.001）；**，差異高度顯著（P﹤0.01）；*，差異顯著（P﹤0.05）。 </p><p>　　3.4.3 培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)液pH和液料比對(duì)麥麩多肽含量的影響</p><p>　　培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)液p

44、H和液料比與麥麩多肽含量之間的關(guān)系的響應(yīng)面圖見(jiàn)圖7～9。</p><p>　　為了更直觀得表現(xiàn)兩個(gè)因素同時(shí)對(duì)響應(yīng)值的影響，可令其他因素水平值為零，僅考慮這兩個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響，即進(jìn)行降維分析。得到的二元二次方程可以繪出相應(yīng)的響應(yīng)面圖和等高線圖。從響應(yīng)面圖分析可知，培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)液pH和液料比對(duì)麥麩多肽的含量的影響為隨著因素的增大，響應(yīng)值增大，當(dāng)響應(yīng)值達(dá)到極值以后，隨著因素的增大，響應(yīng)值逐漸減小。該模型有穩(wěn)定點(diǎn)，

45、且穩(wěn)定點(diǎn)是最大值。</p><p>　　圖7 培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)液pH交互作用的響應(yīng)面圖</p><p>　　圖7表示了液料比為8:1時(shí)，培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)液pH對(duì)麥麩多肽含量的影響。從圖中可知，肽含量的變化隨培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)液pH的變化呈現(xiàn)出較大波動(dòng)，其總體表現(xiàn)為曲線形效應(yīng)。根據(jù)方差分析的結(jié)果可知這兩個(gè)組分之間存在顯著交互作用（P<0.05）。當(dāng)培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)液pH取值較低時(shí)，肽含量隨著二者

46、濃度的提高而提高，但當(dāng)培養(yǎng)溫度大于55℃，培養(yǎng)液pH大于4時(shí)，肽含量反而下降。</p><p>　　圖8表示了培養(yǎng)液pH為4時(shí)，培養(yǎng)溫度和液料比對(duì)麥麩多肽含量的影響。從圖中可知，培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)液pH的交互作用顯著（P<0.05），當(dāng)培養(yǎng)溫度和液料比為55℃和8:1時(shí)，麥麩多肽含量達(dá)到峰值。培養(yǎng)溫度和液料比與多肽含量變化關(guān)系都是先增大后減小，當(dāng)培養(yǎng)溫度大于55℃，液料比大于8:1時(shí)，多肽含量開(kāi)始下降。. &l

47、t;/p><p>　　圖8 培養(yǎng)溫度和液料比交互作用的響應(yīng)面圖</p><p>　　圖9 培養(yǎng)液pH和液料比交互作用的響應(yīng)面圖</p><p>　　圖9表示了培養(yǎng)溫度為55℃時(shí)，培養(yǎng)液pH和液料比對(duì)麥麩多肽含量的影響。從圖中可知，隨著培養(yǎng)液pH和料液比的增加，麥麩多肽含量先增加后降低，在培養(yǎng)液pH和液料比趨于中間值時(shí)多肽含量最高。響應(yīng)曲面坡度較陡峭，表明麥麩多肽含量對(duì)于

48、培養(yǎng)液pH和液料比的改變較敏感。交互作用顯著（P<0.05）。</p><p>　　通過(guò)響應(yīng)面的優(yōu)化預(yù)測(cè)，得到麥麩的最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為55.8℃，培養(yǎng)液pH 4.09和液料比8.11:1。</p><p>　　3.4.4 模型驗(yàn)證</p><p>　　通過(guò)擬合回歸方程可以得到，最適的培養(yǎng)溫度為55.8℃、培養(yǎng)液pH4.09、液料比8.11:1，麥麩中

49、多肽含量的預(yù)測(cè)值為36.60mg/g。經(jīng)驗(yàn)證，以最適條件培養(yǎng)得到麥麩中多肽含量?jī)H僅比預(yù)測(cè)值低0.61%（36.38 mg/g）。預(yù)測(cè)值和實(shí)際值之間存在較高的擬合度，說(shuō)明所建立的模型是可靠的；以最適的條件培養(yǎng)麥麩所得到的麥麩多肽含量是原料（15.23 mg/g）的2.39倍，說(shuō)明優(yōu)化后的培養(yǎng)液能顯著提高麥麩中的多肽含量。</p><p>　　表4 驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果</p><p>　　3.5

50、麥麩多肽抗氧化性的研究</p><p>　　3.5.1 清除羥自由基能力的變化</p><p>　　羥自由基(·OH)是一種氧化能力很強(qiáng)的自由基，有實(shí)驗(yàn)研究表明它是造成生物組織脂質(zhì)過(guò)氧化、核酸斷裂、蛋白質(zhì)和多糖分解的重要活性氧，在人體衰老方面起著特殊的作用，可以導(dǎo)致許多病理變化。鄰二氮菲-Fe2+氧化法主要用于抗氧化研究中檢測(cè)離體實(shí)驗(yàn)體系中羥自由基的氧化作用，是一種比色測(cè)定方法

51、，特別是對(duì)于抗氧化劑的選擇有重要的價(jià)值。圖10顯示了不同醇提液濃度下羥自由基(·OH)的清除率，由圖可見(jiàn)隨著醇提液濃度的升高，羥自由基(·OH)的清除率增大。</p><p>　　3.5 2 清除DPPH·自由基活力的變化</p><p>　　DPPH· （1, 1-二苯基-2-苦肼基）是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，其乙醇溶液呈紫色，在517 nm

52、 處有最大吸收。添加抗氧化物質(zhì)后，其將紫色的DPPH·自由基還原成黃色的非自由基DPPH-H形式。當(dāng)DPPH·溶液中加入自由基清除劑時(shí)，其孤電子被配對(duì)，吸收消失或減弱，導(dǎo)致溶液顏色變淺，在517 nm處的吸光度變小，其變化程度與自由基清除程度呈線形關(guān)系。故該法可以用來(lái)表征某種物質(zhì)對(duì)自由基的清除能力，通常用清除率表示。清除率越大，表明該物質(zhì)清除自由基的能力越強(qiáng)[17]。</p><p>　　通過(guò)

53、實(shí)驗(yàn)得到數(shù)據(jù)繪制成圖11。如圖所示，隨著醇提液濃度的增大，DPPH·的抑制率先增大后減小，在0.2g/mL處達(dá)到最大DPPH·的抑制率31.2%。查資料知相同濃度下Vc對(duì)DPPH·的抑制率為78.4%。</p><p><b>　　結(jié) 論</b></p><p>　　通過(guò)研究不同條件下麥麩多肽含量的變化，得到麥麩多肽富集的優(yōu)化條件，主要

54、結(jié)果如下：</p><p>　　1、 通過(guò)比較檸檬酸緩沖液和醋酸緩沖液對(duì)麥麩多肽富集的影響，得出檸檬酸緩沖液對(duì)麥麩多肽富集的作用最為顯著。通過(guò)研究不同濃度檸檬酸緩沖液對(duì)麥麩多肽富集的影響，得出0.1 mol/L檸檬酸緩沖液最適于麥麩多肽的富集。</p><p>　　2、 單因素分析培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)液pH和液料比四種因素對(duì)麥麩多肽富集的影響，得出四因素的最佳水平分別為：培養(yǎng)溫度55℃

55、、培養(yǎng)時(shí)間6h、培養(yǎng)液pH 4.0、液料比8:1。</p><p>　　3、響應(yīng)面優(yōu)化得到麥麩多肽富集的最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度55.8℃，培養(yǎng)液pH 4.09和液料比8.11:1，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到在該條件下所培養(yǎng)出的麥麩多肽含量為36.3858 mg/g。</p><p>　　4、0.35g/mL麥麩多肽醇提液液對(duì)·OH的清除率為48.7%。相同濃度下Vc對(duì)·OH的清除率

56、為99.8%。說(shuō)明該濃度下麥麩多肽具有一定的清除·OH能力。</p><p>　　5、0.2g/mL麥麩多肽醇提液對(duì)DPPH·的抑制率為31.2%。相同濃度下Vc對(duì)DPPH·的抑制率為78.4%。說(shuō)明麥麩多肽液對(duì)DPPH·具有一定的的抑制率。</p><p><b>　　致 謝</b></p><p>

57、　　本論文是在導(dǎo)師白青云博士的悉心指導(dǎo)下完成的。導(dǎo)師淵博的專業(yè)知識(shí)，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度，精益求精的工作作風(fēng)，誨人不倦的高尚師德，嚴(yán)以律己、寬以待人的崇高風(fēng)范，樸實(shí)無(wú)華、平易近人的人格魅力對(duì)我影響深遠(yuǎn)。不僅使我樹(shù)立了遠(yuǎn)大的學(xué)術(shù)目標(biāo)、掌握了基本的研究方法，還使我明白了許多待人接物與為人處世的道理。本論文從選題到完成，每一步都是在導(dǎo)師的指導(dǎo)下完成的，傾注了導(dǎo)師大量的心血。在此，謹(jǐn)向?qū)煴硎境绺叩木匆夂椭孕牡母兄x！本論文的順利完成，離不開(kāi)各位老師、

58、同學(xué)和朋友的關(guān)心和幫助。在此感謝xx老師的指導(dǎo)和幫助；感謝實(shí)驗(yàn)室各位老師的指導(dǎo)和幫助；感謝淮陰工學(xué)院的關(guān)心、支持和幫助；在這幾年的學(xué)習(xí)期間，得到各位師兄和師弟妹的關(guān)心和幫助，在此表示深深的感謝。沒(méi)有他們的幫助和支持是沒(méi)有辦法完成我的學(xué)位論文的，同窗之間的友誼永遠(yuǎn)長(zhǎng)存。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　1 龐廣昌，王秋韞，陳慶森．生物活

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