轉(zhuǎn)細(xì)胞凋亡抑制基因p35和iap玉米抗紋枯病的研究.pdf

1、玉米紋枯病是一種分布范圍較廣的世界性真菌病害，其病原菌主要是立枯絲核菌（Rhizoctonia solani kühn），它具有強(qiáng)腐生性和寬寄主范圍，目前尚未挖掘出高抗或免疫紋枯病的玉米新品種，玉米紋枯病的防治還主要依賴于化學(xué)防治和農(nóng)業(yè)防治。為了得到具備廣譜和持久抗性的玉米新種質(zhì)，抵抗死體營(yíng)養(yǎng)型病原菌誘發(fā)的病害，本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米遺傳轉(zhuǎn)化的方法將分別來(lái)源于苜蓿斜紋夜蛾昆蟲(chóng)桿狀病毒和甜菜夜蛾中的凋亡抑制基因p35、iap同時(shí)導(dǎo)入玉米

2、中。
　　 本實(shí)驗(yàn)分別構(gòu)建了融合基因表達(dá)載體和雙價(jià)表達(dá)載體。在構(gòu)建融合基因表達(dá)載體中，依據(jù)目的基因p35和iap的編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)了6條引物;為了使兩基因能夠高效表達(dá)，除了使用連接多肽LP4/2A構(gòu)建融合基因之外，設(shè)計(jì)引物時(shí)，我們對(duì)位于融合基因之前的p35基因的起始密碼子的周邊序列進(jìn)行了優(yōu)化，引入了Kozak序列，并在位于融合基因之后的iap基因和啟動(dòng)子之前引入了Ω序列，它是來(lái)源于煙草花葉病毒(TMV)富含TTAAC序列的非翻譯前

3、導(dǎo)序列，常作為增強(qiáng)子使用;從植物表達(dá)載體pCAMBIA1305.1-p35和pBI121-iap中分別擴(kuò)增出p35和iap兩個(gè)基因，p35基因的大小為900bp，iap基因的大小為1137bp;利用重疊PCR技術(shù)(overlappingPCR)將p35和iap兩基因用連接多肽LP4/2A連接起來(lái)形成融合基因p35-LP4/2A-iap，置于玉米泛素啟動(dòng)子UBI-1之后，連接到植物表達(dá)載體pCABIA3301中，構(gòu)建成融合基因表達(dá)載體pC

4、A3301-p35-LP4/2A-iap。在構(gòu)建雙價(jià)表達(dá)載體時(shí)，將p35和iap基因各置于一套表達(dá)框內(nèi)，p35基因由玉米泛素啟動(dòng)子UBI-1啟動(dòng)，置于植物表達(dá)載體pCAMBIA3301的多克隆位點(diǎn)中;iap基因由CaMV35S啟動(dòng)子啟動(dòng)，取代pCAMBIA3301上的gus基因，形成雙價(jià)表達(dá)載體pCA3301-p35-iap。經(jīng)PCR檢測(cè)、酶切驗(yàn)證和全長(zhǎng)測(cè)序驗(yàn)證，兩表達(dá)載體上的各目的片段序列完整正確，連接無(wú)誤。
　　 通過(guò)農(nóng)桿菌

5、介導(dǎo)玉米遺傳轉(zhuǎn)化方法將構(gòu)建好的表達(dá)載體上的目的基因?qū)胗衩鬃越幌礎(chǔ)188和綜31中，共得到52株成活的轉(zhuǎn)基因玉米，經(jīng)巢氏PCR檢測(cè)，共有19株轉(zhuǎn)基因植株呈PCR陽(yáng)性，初步確定外源基因已經(jīng)整合到這19株轉(zhuǎn)基因玉米的基因組中。
　　 對(duì)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株的離體葉片接種立枯絲核菌（Rhizoctonia solanikühn），觀察發(fā)病情況。接種3天后，觀察到對(duì)照植株的葉片發(fā)病比較嚴(yán)重，出現(xiàn)大塊的病斑;而轉(zhuǎn)基因植株中有6株的