寒蘭內(nèi)參基因的篩選和DREB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)分析.pdf

1、寒蘭(Cymbidium kanran Mak)屬于蘭科(Orchidaceae)蘭屬(Cymbidium)，是國蘭的重要成員，具有株型修長，葉姿優(yōu)雅俊秀，香味清醇等特點(diǎn)，有極高的觀賞價值和經(jīng)濟(jì)價值。采用傳統(tǒng)的育種方法已經(jīng)不能滿足人們對寒蘭品種新、奇、特及多抗的要求。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，采用基因工程技術(shù)對寒蘭進(jìn)行新品種培育及抗逆性改良已成為一個新的突破口。本研究以寒蘭為實(shí)驗(yàn)材料，首先采用RT-PCR技術(shù)篩選出在寒蘭中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參

2、基因，再將篩選的穩(wěn)定基因用于寒蘭DREB基因的表達(dá)分析，得到結(jié)果如下:
　　 1.寒蘭內(nèi)參基因的篩選
　　 qRT-PCR技術(shù)結(jié)合生物學(xué)軟件(geNorm、NormFinder)評價了9個常用的內(nèi)參基因在寒蘭不同組織中以及激素處理和非生物脅迫條件下的表達(dá)穩(wěn)定性。非生物脅迫包括低溫、高溫、鹽、干旱、重金屬脅迫等，不同組織包括萼片、花瓣、唇瓣、合蕊柱、根、莖和葉，激素處理包括ABA、GA、NAA、6-BA處理等。我們將得到的

3、熒光定量PCR數(shù)據(jù)分別用geNorm和NormFinder分析，以便篩選出合適的內(nèi)參基因。比較geNorm和NormFinder兩個軟件的分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩個軟件的分析結(jié)果基本相同，只是在不同處理的根中，出現(xiàn)了一些不一致。進(jìn)一步分析表明，這主要是由于這兩個分析軟件所基于的原理不同而造成的。綜合兩個軟件的分析結(jié)果表明，在涉及到多個處理和組織器官時，Actin和TUB表達(dá)最穩(wěn)定;在不同組織中，RPS3和rpoB最適合作內(nèi)參基因;Actin和T

4、UB在不同處理的根中表達(dá)最穩(wěn)定;而在不同處理下的葉片中，Actin和28S作為內(nèi)參基因最為可靠。
　　 2.DREB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)分析
　　 應(yīng)用qRT-PCR分析受高溫、高鹽、水澇等處理的24株寒蘭，明確了寒蘭DREB基因在不同逆境中的表達(dá)情況，確定了寒蘭對脅迫誘導(dǎo)的應(yīng)激能力。在熱處理情況下，DREB基因的表達(dá)開始會迅速升高，在1h達(dá)到最高峰后緩慢下降，并在24h時再次急劇增加，達(dá)到最高峰，然后表達(dá)量又會逐漸下降。在進(jìn)

5、行高鹽處理時，DREB基因的表達(dá)量在30min時會逐漸下降，然后急劇增加，在2小時時達(dá)到最高峰，此后，該基因的表達(dá)量會逐漸降低，24h時會再次達(dá)到高后又逐漸降低。在進(jìn)行水澇脅迫處理時，DREB基因的表達(dá)量會逐漸增加，并且在2h時達(dá)到最高峰，此后，DREB基因的表達(dá)量會急劇減少，在第24h時，該基因的表達(dá)量又會逐漸增加，然后會再次降低。這些結(jié)果顯示，DREB基因在寒蘭受到脅迫誘導(dǎo)后能迅速表達(dá)，這表明DREB對于寒蘭抵抗脅迫具有非常重要的調(diào)