魔芋內(nèi)參基因篩選及HSFA1基因表達(dá)分析.pdf

1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（RT-qPCR）目前是分析基因表達(dá)的常用方法，而穩(wěn)定的內(nèi)參基因是準(zhǔn)確定量基因表達(dá)水平的先決條件。魔芋是我國(guó)西南地區(qū)的一類價(jià)值較高的蔬菜作物，研究魔芋中一些重要的功能基因?qū)δв筮z傳改良有重大幫助。由于基因組數(shù)據(jù)的限制，魔芋中尚未篩選出穩(wěn)定的內(nèi)參基因，內(nèi)參基因的篩選能夠?yàn)楹罄m(xù)重要功能基因的表達(dá)分析提供重要的理論支撐，有著重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。此外，魔芋是一種不耐熱的作物，目前只適應(yīng)在中高海拔地區(qū)種植，研究魔芋熱害脅迫

2、下主調(diào)控因子Heat shock transcription factor A1（HSFA1）基因的表達(dá)情況，有助于了解魔芋的耐熱調(diào)控機(jī)制，對(duì)魔芋耐熱改良有重要的理論幫助。
　　以白魔芋（Amorphophallus albus）和花魔芋（Amorphophallus konjac）為試材，采用同源克隆法，克隆了包括 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）、Elongatio

3、n factor1-α（EF1-a）、Eukaryotic initiation factor4A（EIF4A）、H3.2 histones（H3）、Cyclophilin（CYP）、β-Actin（ACTB）、β-Tubulin（TUB）、Ubiquitin（UBQ）、Ribosomal protein L16（RP）在內(nèi)的9個(gè)候選內(nèi)參基因及HSFA1基因保守區(qū)部分序列，鑒定了候選內(nèi)參基因在熱害脅迫、雨澇脅迫及不同組織間表達(dá)的穩(wěn)定性，

4、通過(guò)cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)獲得了HSFA1基因的全長(zhǎng)，預(yù)測(cè)了其編碼讀碼框，并通過(guò)洋蔥表皮亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)鑒定了魔芋HSFA1基因的亞細(xì)胞定位模式。同時(shí)以篩選出的穩(wěn)定的內(nèi)參基因組合作為內(nèi)部對(duì)照，分析了兩個(gè)魔芋種的不同組織中（葉和根）HSFA1基因在41℃高溫處理0-8 h時(shí)的相對(duì)表達(dá)情況。主要結(jié)果如下：
　　1、克隆了白魔芋、花魔芋中9個(gè)內(nèi)參基因
　　采用同源克隆法，根據(jù)NCBI中親緣關(guān)系較近物種的同源保守序列，從

5、兩個(gè)魔芋種中克隆出其他作物中9個(gè)常用內(nèi)參基因（GADPH、ACTB、RP、UBQ、H3、TUB、CYP、EIF4A、EF1-α）的編碼區(qū)保守性片段。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，預(yù)測(cè)了編碼的氨基酸殘基，通過(guò)構(gòu)建發(fā)育樹(shù)，比較了物種之間的親緣關(guān)系，結(jié)果顯示，與魔芋親緣關(guān)系最近的是天南星科中的花燭等植物，這些植物與魔芋同科，此外與魔芋親緣關(guān)系較近的還有單子葉植物棕櫚科的非洲油棕（Elaeis guineensis）、海棗（Phoenix dactylifer

6、a）及芭蕉科的野生芭蕉亞種（Musa acuminata subsp.）等，這為魔芋相關(guān)基因的同源克隆提供了借鑒。
　　2、比較了三種實(shí)驗(yàn)條件下兩個(gè)魔芋種中穩(wěn)定的內(nèi)參基因
　　應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)，設(shè)計(jì)定量引物，計(jì)算了不同組織間、熱害脅迫及雨澇脅迫下候選內(nèi)參基因表達(dá)Cq值。根據(jù)geNorm、NormFinder、BestKeeper三個(gè)算法計(jì)算了不同候選基因的穩(wěn)定值，并比較了穩(wěn)定值結(jié)果，鑒定了不同實(shí)驗(yàn)情況下（熱害脅迫、雨澇

7、脅迫及不同組織間）兩個(gè)魔芋種中穩(wěn)定內(nèi)參基因。結(jié)果表明 EF1-α和EIF4A是所有集合中最穩(wěn)定的2個(gè)內(nèi)參基因，EF1-α、EIF4A、H3和UBQ是熱害脅迫下較穩(wěn)定的內(nèi)參基因；EF1-α、EIF4A和TUB是雨澇脅迫下最穩(wěn)定的內(nèi)參基因；EF1-α、EIF4A和CYP是不同組織間最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。
　　3、分離到兩個(gè)魔芋種的HSFA1基因
　　依據(jù)保守氨基酸序列和密碼子的偏好性，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，分離得到長(zhǎng)1221 bp的基因片段

8、。利用RACE技術(shù)分離到魔芋HSFA1上游及下游片段，拼接結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因全長(zhǎng)為1909 bp，ORF finder預(yù)測(cè)了1569 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼了522個(gè)氨基酸殘基，通過(guò)設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物，驗(yàn)證了RACE擴(kuò)增結(jié)果準(zhǔn)確性。結(jié)構(gòu)域分析顯示該基因具備與其他物種HSFA1基因相似的結(jié)構(gòu)域，C端含有AHA基序，能夠激活下游基因表達(dá)；生物信息學(xué)預(yù)測(cè)其與單子葉植物的親緣關(guān)系較近，但相似度均在81％以下；跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)其不含有跨膜結(jié)構(gòu)。
　　4、

9、分析了兩個(gè)蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞中的定位情況
　　通過(guò)構(gòu)建pCHF3-AkHSFA1-YFP和pCHF3-AaHSFA1-YFP融合表達(dá)載體，確定了在洋蔥表皮細(xì)胞的定位情況，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)蛋白主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。
　　5、鑒定了兩個(gè)魔芋種中HSFA1基因不同組織的相對(duì)表達(dá)模式
　　對(duì)魔芋材料41℃高溫處理，應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)，以EF1-α+H3+UBQ作為內(nèi)參基因，分析了0-8 h HSFA1基因在白魔芋和花魔芋葉片

10、和根兩個(gè)組織中表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)HSFA1的表達(dá)水平在2個(gè)中整體呈現(xiàn)出增強(qiáng)的趨勢(shì)，均在熱處理2 h時(shí)表達(dá)達(dá)到頂峰，說(shuō)明了魔芋為熱敏感型作物；不同組織間比較發(fā)現(xiàn)，該基因在葉片中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于根中，表明HSFA1在葉片中的表達(dá)豐度高；兩個(gè)種之間的表達(dá)量比較發(fā)現(xiàn)，AaHSFA1的表達(dá)量在不同時(shí)段均高于AkHSFA1，從分子生物學(xué)角度進(jìn)一步說(shuō)明了白魔芋耐熱性強(qiáng)于花魔芋。
　　綜上，本研究的結(jié)果為魔芋基因表達(dá)分析與耐熱調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的解析提供了重要的