魔芋內參基因篩選及HSFA1基因表達分析.pdf

1、實時熒光定量PCR技術（RT-qPCR）目前是分析基因表達的常用方法，而穩(wěn)定的內參基因是準確定量基因表達水平的先決條件。魔芋是我國西南地區(qū)的一類價值較高的蔬菜作物，研究魔芋中一些重要的功能基因對魔芋遺傳改良有重大幫助。由于基因組數(shù)據(jù)的限制，魔芋中尚未篩選出穩(wěn)定的內參基因，內參基因的篩選能夠為后續(xù)重要功能基因的表達分析提供重要的理論支撐，有著重要的理論和應用價值。此外，魔芋是一種不耐熱的作物，目前只適應在中高海拔地區(qū)種植，研究魔芋熱害脅迫

2、下主調控因子Heat shock transcription factor A1（HSFA1）基因的表達情況，有助于了解魔芋的耐熱調控機制，對魔芋耐熱改良有重要的理論幫助。
　　以白魔芋（Amorphophallus albus）和花魔芋（Amorphophallus konjac）為試材，采用同源克隆法，克隆了包括 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）、Elongatio

3、n factor1-α（EF1-a）、Eukaryotic initiation factor4A（EIF4A）、H3.2 histones（H3）、Cyclophilin（CYP）、β-Actin（ACTB）、β-Tubulin（TUB）、Ubiquitin（UBQ）、Ribosomal protein L16（RP）在內的9個候選內參基因及HSFA1基因保守區(qū)部分序列，鑒定了候選內參基因在熱害脅迫、雨澇脅迫及不同組織間表達的穩(wěn)定性，

4、通過cDNA末端快速擴增（RACE）技術獲得了HSFA1基因的全長，預測了其編碼讀碼框，并通過洋蔥表皮亞細胞定位實驗鑒定了魔芋HSFA1基因的亞細胞定位模式。同時以篩選出的穩(wěn)定的內參基因組合作為內部對照，分析了兩個魔芋種的不同組織中（葉和根）HSFA1基因在41℃高溫處理0-8 h時的相對表達情況。主要結果如下：
　　1、克隆了白魔芋、花魔芋中9個內參基因
　　采用同源克隆法，根據(jù)NCBI中親緣關系較近物種的同源保守序列，從

5、兩個魔芋種中克隆出其他作物中9個常用內參基因（GADPH、ACTB、RP、UBQ、H3、TUB、CYP、EIF4A、EF1-α）的編碼區(qū)保守性片段。根據(jù)測序結果，預測了編碼的氨基酸殘基，通過構建發(fā)育樹，比較了物種之間的親緣關系，結果顯示，與魔芋親緣關系最近的是天南星科中的花燭等植物，這些植物與魔芋同科，此外與魔芋親緣關系較近的還有單子葉植物棕櫚科的非洲油棕（Elaeis guineensis）、海棗（Phoenix dactylifer

6、a）及芭蕉科的野生芭蕉亞種（Musa acuminata subsp.）等，這為魔芋相關基因的同源克隆提供了借鑒。
　　2、比較了三種實驗條件下兩個魔芋種中穩(wěn)定的內參基因
　　應用RT-qPCR技術，設計定量引物，計算了不同組織間、熱害脅迫及雨澇脅迫下候選內參基因表達Cq值。根據(jù)geNorm、NormFinder、BestKeeper三個算法計算了不同候選基因的穩(wěn)定值，并比較了穩(wěn)定值結果，鑒定了不同實驗情況下（熱害脅迫、雨澇

7、脅迫及不同組織間）兩個魔芋種中穩(wěn)定內參基因。結果表明 EF1-α和EIF4A是所有集合中最穩(wěn)定的2個內參基因，EF1-α、EIF4A、H3和UBQ是熱害脅迫下較穩(wěn)定的內參基因；EF1-α、EIF4A和TUB是雨澇脅迫下最穩(wěn)定的內參基因；EF1-α、EIF4A和CYP是不同組織間最穩(wěn)定的內參基因。
　　3、分離到兩個魔芋種的HSFA1基因
　　依據(jù)保守氨基酸序列和密碼子的偏好性，設計簡并引物，分離得到長1221 bp的基因片段

8、。利用RACE技術分離到魔芋HSFA1上游及下游片段，拼接結果發(fā)現(xiàn)該基因全長為1909 bp，ORF finder預測了1569 bp的開放閱讀框，編碼了522個氨基酸殘基，通過設計全長引物，驗證了RACE擴增結果準確性。結構域分析顯示該基因具備與其他物種HSFA1基因相似的結構域，C端含有AHA基序，能夠激活下游基因表達；生物信息學預測其與單子葉植物的親緣關系較近，但相似度均在81％以下；跨膜結構預測其不含有跨膜結構。
　　4、

9、分析了兩個蛋白在洋蔥表皮細胞中的定位情況
　　通過構建pCHF3-AkHSFA1-YFP和pCHF3-AaHSFA1-YFP融合表達載體，確定了在洋蔥表皮細胞的定位情況，發(fā)現(xiàn)兩個蛋白主要定位于細胞核和細胞質中。
　　5、鑒定了兩個魔芋種中HSFA1基因不同組織的相對表達模式
　　對魔芋材料41℃高溫處理，應用RT-qPCR技術，以EF1-α+H3+UBQ作為內參基因，分析了0-8 h HSFA1基因在白魔芋和花魔芋葉片

10、和根兩個組織中表達情況，發(fā)現(xiàn)HSFA1的表達水平在2個中整體呈現(xiàn)出增強的趨勢，均在熱處理2 h時表達達到頂峰，說明了魔芋為熱敏感型作物；不同組織間比較發(fā)現(xiàn)，該基因在葉片中的表達量遠高于根中，表明HSFA1在葉片中的表達豐度高；兩個種之間的表達量比較發(fā)現(xiàn)，AaHSFA1的表達量在不同時段均高于AkHSFA1，從分子生物學角度進一步說明了白魔芋耐熱性強于花魔芋。
　　綜上，本研究的結果為魔芋基因表達分析與耐熱調控網(wǎng)絡的解析提供了重要的