小麥轉(zhuǎn)錄抑制因子TaASP1基因的克隆和表達(dá)分析.pdf

1、植物的胚胎后發(fā)育取決于分生組織的活性，因此分生組織中細(xì)胞的命運(yùn)對(duì)植物的發(fā)育和株型至關(guān)重要。轉(zhuǎn)錄抑制因子通過(guò)與其他蛋白的互作，從而對(duì)基因的表達(dá)起相應(yīng)的抑制作來(lái)調(diào)節(jié)基因的功能。目前已報(bào)道的植物轉(zhuǎn)錄因子包括擬南芥TOPLESS（TPL），玉米R(shí)AMOSA1 ENHANCER LOCUS2(REL2)和水稻ABERRANT SPIKELET AND PANICLE1(ASP1)均屬于轉(zhuǎn)錄抑制因子TUP1家族。這類轉(zhuǎn)錄因子能調(diào)控發(fā)育及生理反應(yīng)的多

2、個(gè)方面，如穗、枝梗和小穗等的發(fā)育，同時(shí)對(duì)葉腋分生組織的維持起重要作用。本研究以普通小麥作為研究材料，通過(guò)電子克隆及PCR克隆等方法，分離得到小麥TaASP1基因序列，并對(duì)該基因的表達(dá)模式及功能進(jìn)行了初步的研究，為深入解析該基因在小麥形態(tài)發(fā)育和環(huán)境應(yīng)答等方面的作用奠定基礎(chǔ)。本研究的主要結(jié)果如下:
　　1.以水稻OsASP1基因(GenBank登錄號(hào):AK111830)的cDNA序列為模板，Blast檢索NCBI中小麥EST數(shù)據(jù)庫(kù)，選

3、取同源性較高的7對(duì)EST序列進(jìn)行拼接，獲得包含完整開(kāi)放閱讀框(ORF)的3591bp序列;并以該序列為模板設(shè)計(jì)4對(duì)相互重疊特異引物，利用中國(guó)春cDNA進(jìn)行PCR克隆，每對(duì)引物均獲得單一條帶，回收克隆測(cè)序分別得到1284bp、1098bp、1072bp和1500bp序列，經(jīng)拼接得到全長(zhǎng)3527bp的序列，經(jīng)與OsASP1基因比對(duì)，相似度為89％，其中ORF全長(zhǎng)為3402bp，編碼1133個(gè)氨基酸殘基，具有轉(zhuǎn)錄抑制因子TPL的特征區(qū)域，表明

4、克隆所獲得的序列為小麥轉(zhuǎn)錄抑制因子序列，命名為TaASP1。
　　2.基于克隆獲得的cDNA序列，分別在外顯子區(qū)設(shè)計(jì)8對(duì)相互重疊引物，利用野生一粒小麥（T.boeoticum，AA）PI10474分段擴(kuò)增TaASP1基因DNA序列，每對(duì)引物均獲得單一條帶，測(cè)序分別獲得1162bp、1355bp、1163bp、1244bp、1142bp、920bp、1331bp和1064bp的8段序列序列，經(jīng)拼接獲得全長(zhǎng)8076bp的序列，通與克隆

5、得到的cDNA序列比表明，該基因包含3402bp的外顯子區(qū)和4674bp的內(nèi)含子區(qū)，含有25個(gè)外顯子和24個(gè)內(nèi)含子。
　　3.將從野生一粒小麥PI10474克隆得到的小麥TaASP1基因與其他植物中TPL亞家族基因進(jìn)行蛋白序列比對(duì)，小麥TaASP1與水稻ASP1、玉米R(shí)EL2和擬南芥TPL的蛋白序列相似性分別為92.5％、90.73％和65.51％;小麥TaASP1具有TPL轉(zhuǎn)錄因子家族的LisH、CTLH和WD40保守結(jié)構(gòu)域;小

6、麥TaASP1的LisH區(qū)域與玉米R(shí)EL2和擬南芥TPL完全相同，與水稻ASP1的相似性達(dá)到96.77％，小麥ASP1蛋白的CTLH區(qū)域與水稻ASP1、玉米R(shí)EL2和擬南芥TPL的相似性分別為98.28％、98.28％和82.76％。
　　4.利用前文中設(shè)計(jì)的引物DF2/DR2以21套中國(guó)春缺體-四體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果在24個(gè)材料中均能擴(kuò)增出條帶。利用前文中從野生一粒小麥中克隆得到的DNA序列，在小麥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)URGI檢索，

7、將TaASP1基因定位于7A、7B和7D染色體上;序列比對(duì)分析表明在始密碼子上游700bp處，相對(duì)于7A和7B，7D位點(diǎn)存在100bp的缺失，以此缺失為模板設(shè)計(jì)特異引物TF/TR，對(duì)21套中國(guó)春缺體-四體材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果在N7DT7B中僅擴(kuò)增到一條帶，而在其他材料中均擴(kuò)增到兩條帶，進(jìn)一步表明小麥TaASP1基因位于7A、7B和7D染色體上。
　　5.以ACTIN基因?yàn)閮?nèi)參，以QF/QR作為目的基因引物，采用熒光定量PCR(

8、QRT-PCR)分析了TaASP1基因在普通小麥中國(guó)春、10-A和E89抽穗期和孕穗期的穗、莖和葉片等部位的表達(dá)模式。結(jié)果表明，TaASP1基因在中國(guó)春灌漿時(shí)期的穗、莖、葉、種子和根部均有表達(dá)，但是在穗和莖中的表達(dá)量相對(duì)較高;在穗發(fā)育的不同階段，該基因在穗部的表達(dá)相對(duì)比較穩(wěn)定，在0.5-3.0cm時(shí)，表達(dá)量持續(xù)的增高，3.0-6.0cm時(shí)，表達(dá)量稍微有所下降;此外，10-A在穗、莖和葉三個(gè)部位的表達(dá)量均稍高于中國(guó)春和E89，莖部的表達(dá)量

9、明顯高于穗和葉，推測(cè)小麥TaASP1基因可能在莖節(jié)伸長(zhǎng)生長(zhǎng)和穗發(fā)育中具有重要作用。
　　6.以小麥TaASP1基因的cDNA序列起始密碼子后的1248bp包含信號(hào)肽序列為目標(biāo)序列，設(shè)計(jì)特異引物通過(guò)PCR擴(kuò)增在序列兩端分別添加BglⅡ和SpeⅠ雙酶切位點(diǎn)，經(jīng)雙酶切處理后插入經(jīng)同樣雙酶切處理過(guò)的真核表達(dá)載體pCAMBIA1302的35S啟動(dòng)子和GFP中間，構(gòu)建的真核重組質(zhì)粒35S∶TaASP1-GFP。將構(gòu)建的新載體利用基因槍轟擊洋蔥

10、表皮細(xì)胞，在475nm藍(lán)光激發(fā)下，對(duì)照組原始質(zhì)粒pCAMBIA1302在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均可以檢測(cè)到綠色熒光，而新構(gòu)建的重組質(zhì)粒35S∶TaASP1-G FP只有在細(xì)胞核中檢測(cè)到了綠色熒光，表明小麥TaASP1基因亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核中。
　　7.以中國(guó)春基因組DNA為模板，以小麥TaASP1起始密碼子ATG上游1557bp的序列作為目標(biāo)序列，設(shè)計(jì)特異引物通過(guò)PCR擴(kuò)增在序列兩端分別添加HindⅢ和BamhⅠ雙酶切位點(diǎn)，經(jīng)雙