根際來源銅綠假單胞菌生防株M18全基因組與溫度依賴轉(zhuǎn)錄組的比較分析研究.pdf

1、假單胞菌M18是本實驗室1996年在上海郊區(qū)甜瓜根際分離的高產(chǎn)兩種抗生素吩嗪-1-羧酸和藤黃綠菌素的植物生防菌，其產(chǎn)品申嗪霉素已廣泛應(yīng)用于我國的植物保護工作中，對于我國糧食生產(chǎn)安全具有重要的保障作用。而本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)M18菌株與條件性致病菌銅綠假單胞菌遺傳背景最為接近，但該菌株又與銅綠假單胞菌在表型和基因調(diào)控方式上存在巨大差異，因此闡明假單胞菌M18的遺傳組成，對研究其生防機理具有重要意義。
　　 本論文從基因組、表型、轉(zhuǎn)

2、錄組和基因組島功能等角度，分析了M18菌株特殊基因組的特點，對于環(huán)境響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組變化和特定基因組島的功能，以期發(fā)掘該菌株的優(yōu)良生防功能和獨特基因組結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的原因，主要結(jié)果如下:
　　 第一、利用下一代高通量測序技術(shù)，本文全基因組測序M18菌株基因組，發(fā)現(xiàn)M18基因組由一條長6327754bp的環(huán)狀染色體構(gòu)成，含有5684個編碼基因和80個RNA基因。序列分析顯示M18菌株基因組序列與已測序銅綠假單胞菌基因組同源性最高，達到90％

3、以上，并且全基因組比對、進化樹分析和COG基因分類比較均顯示相同現(xiàn)象，因此將該生防菌株定名為Pseudomonas aeruginosaM18?；蚪M水平分析發(fā)現(xiàn)，相比其它人體分離的銅綠假單胞菌基因組，根際分離的M18菌株基因組具有多個特點，包括含有最多數(shù)量的CRISPR和最少的IS遺傳元件，有助于維持其基因組穩(wěn)定。此外，M18菌株附加基因組不含任何臨床分離株的致病性基因組島，由5個基因組島和2個原噬菌體島組成，其中含有限制性修飾系統(tǒng)、

4、抗生素合成、糖基化修飾、營養(yǎng)物分解等功能基因，有助于M18菌株的根際環(huán)境適應(yīng)。同時，M18菌株基因組攜帶5類次生生防相關(guān)代謝產(chǎn)物的合成基因簇，也對菌株的生防作用起到重要作用。
　　 第二、本文通過研究銅綠假單胞菌M18和近源高致病性菌株的致病性基因和耐藥性基因，發(fā)現(xiàn)兩個菌株存在致病基因上存在多處基因差異，在核心基因組中的耐藥性基因上差異較小。之后，開展小鼠肺部急性感染競爭和抗菌劑抗性試驗，結(jié)果顯示M18菌株株易于清除，且對慶大霉

5、素和卡那霉素等較為敏感。因此，本章結(jié)果顯示和耐藥性均弱于近源高致病性菌株，提示不同環(huán)境進化壓力對于銅綠假單胞不同菌株遺傳組成和表型的巨大作用。
　　 第三、采用定制DNA芯片技術(shù)，本文檢測了根際分離株M18和模式臨床分離株P(guān)AO1，在各自典型生境溫度下（根際溫度28℃、人體溫度37℃）的轉(zhuǎn)錄組變化情況。比較分析發(fā)現(xiàn)不同環(huán)境條件對于銅綠假單胞菌轉(zhuǎn)錄組影響明顯大于基因組，不同菌株在適應(yīng)非原環(huán)境條件時，調(diào)動更多基因表達以適應(yīng)新環(huán)境條件

6、。此外，結(jié)果還顯示，根際來源菌株M18在土壤溫度下，22個基因組島中基因表達上調(diào)，但在人體環(huán)境溫度下，卻沒有發(fā)現(xiàn)任何基因組島中基因被誘導(dǎo)表達，提示附加基因組的表達對于細菌的環(huán)境適應(yīng)性具有重要影響。
　　 第四、序列分析發(fā)現(xiàn)，根際分離銅綠假單胞菌株M18附加基因組由5個基因島和兩個原噬菌體組成，缺少決定人體致病性輔基因島和噬菌體。M18菌株特有基因組島MGI-Ⅰ和MGI-Ⅱ分別含有一套含完整亞基的限制性修飾（RM）系統(tǒng)，在近源株沒

7、有發(fā)現(xiàn)完整RM系統(tǒng)，并且兩個菌株的附加基因組具有明顯差異。因此，本文首先試驗發(fā)現(xiàn)兩個基因組島是可以環(huán)切出M18染色體，結(jié)合GC含量差異暗示這兩個基因組島為新近引入M18基因組中。隨后，敲除基因島上RM系統(tǒng)限制亞基基因后發(fā)現(xiàn)這些系統(tǒng)具有限制外源DNA通過轉(zhuǎn)化和接合方式進入細胞的作用，證明這些RM系統(tǒng)具有限制外源遺傳物質(zhì)進入的功能。這些結(jié)果提示RM基因組島對于M18菌株基因組結(jié)構(gòu)形成的重要功能，提示基因組島在M18菌株維持基因組穩(wěn)定，以適應(yīng)