銅綠假單胞菌SJTD-1烷烴誘導(dǎo)的差異蛋白組研究.pdf

1、來(lái)自石油污染土壤的銅綠假單胞菌株 SJTD-1可利用長(zhǎng)鏈烷烴作為唯一碳源生長(zhǎng)。我們已經(jīng)測(cè)定并詳細(xì)分析了假單胞菌株SJTD-1全基因組序列，證實(shí)銅綠假單胞菌株SJTD-1具有若干個(gè)烷烴降解酶的編碼基因，推測(cè)與烷烴降解有關(guān)。然而假單胞菌株SJTD-1如何利用長(zhǎng)鏈烷烴作為唯一碳源生存，編碼烷烴降解酶的基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制是如何運(yùn)行的我們一無(wú)所知。因此，本課題利用蛋白組相對(duì)定量技術(shù)分析SJTD-1的烷烴誘導(dǎo)差異蛋白組，從中鑒定與烷烴降解有關(guān)的蛋白

2、，闡明烷烴降解機(jī)制。
　　為了建立蛋白組相對(duì)定量技術(shù)平臺(tái)，本課題組建立了SDS-PAGE-1DLC-MS和offline-2DLC-MS兩種蛋白組學(xué)定性技術(shù)，為研究銅綠假單胞菌SJTD-1差異蛋白組學(xué)的研究提供技術(shù)支撐。利用這兩種技術(shù)平臺(tái)分別鑒定獲得1453和1623個(gè)可信蛋白；兩種技術(shù)共鑒定到1912個(gè)可信蛋白。比較兩種技術(shù)路線所鑒定到的蛋白種類(lèi)差異，結(jié)果表明offline-2DLC-MS有利于SJTD-1菌株的膜蛋白、相對(duì)分子

3、質(zhì)量較大的蛋白和pI值不大于8的蛋白的鑒定；SDS-PAGE-1DLC-MS有利于pI值≥8，相對(duì)分子量較小的蛋白鑒定。另外對(duì)所有鑒定到的可信蛋白進(jìn)行了 GO功能注釋?zhuān)瑏喖?xì)胞定位分析和代謝通路富集分析。總之，通過(guò)以上兩種鑒定方法，我們獲得銅綠假單胞SJTD-1菌株全蛋白組，為進(jìn)一步分析 SJTD-1與石油分解相關(guān)的關(guān)鍵代謝通路和相關(guān)蛋白提供了重要的線索和技術(shù)支撐。
　　我們利用構(gòu)建好的SDS-PAGE-1DLC-MS和offlin

4、e-2DLC-MS兩種技術(shù)平臺(tái)建立了iTRAQ和lable-free相對(duì)定量技術(shù)研究假單胞菌烷烴誘導(dǎo)的差異蛋白組。通過(guò)兩次iTRAQ相對(duì)定量蛋白組學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，我們共到鑒定1871個(gè)可信蛋白，10996個(gè)唯一肽段。利用Mann Whitney Test檢驗(yàn)兩組數(shù)據(jù)的重復(fù)性，最終我們獲得了476差異蛋白。其中267個(gè)差異蛋白在正十八烷烴（C18）生長(zhǎng)條件下表達(dá)量提高，209個(gè)蛋白在C18條件下表達(dá)降低。另外，我們應(yīng)用非標(biāo)記相對(duì)定量蛋白組學(xué)技

5、術(shù)研究在烷烴誘導(dǎo)條件下假單胞菌差異蛋白組，我們共鑒定到1966個(gè)蛋白，24514個(gè)唯一肽段；差異蛋白為571個(gè)，其中C18條件下生長(zhǎng)表達(dá)量提高的蛋白有325個(gè)，C18條件下表達(dá)降低的下調(diào)蛋白是246個(gè)蛋白。因此iTRAQ和lable-free兩種相對(duì)定量技術(shù)總共鑒定到可信蛋白2287個(gè)，占銅綠假單胞菌株SJTD-1基因組可預(yù)測(cè)編碼的5618個(gè)蛋白的40.70％。兩種技術(shù)總共鑒定到的差異蛋白為815個(gè)，其中上調(diào)464，下調(diào)351。

6、　　對(duì)這些差異蛋白進(jìn)行了GO功能分類(lèi)和KEGG代謝通路分析，發(fā)現(xiàn)AlkB2（SJTD-1_3623編碼）和另一個(gè)與AlmA-like黃素單加氧酶有一定同源性的蛋白（SJTD-1_3636編碼）的表達(dá)量明顯上調(diào)，說(shuō)明AlkB2和AlmA-like黃素單加氧酶的表達(dá)受C18強(qiáng)烈誘導(dǎo)。另外還發(fā)現(xiàn)alkB1和FAD依賴(lài)的單加氧酶表達(dá)上調(diào)。這是首次發(fā)現(xiàn)假單胞菌的四種單加氧酶受長(zhǎng)鏈烷烴誘導(dǎo)，為研究長(zhǎng)鏈烷烴代謝機(jī)制提供了重要的數(shù)據(jù)依據(jù)。GntR調(diào)控蛋

7、白有可能是 alkB2的調(diào)控蛋白，組學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示 GntR調(diào)控蛋白表達(dá)上調(diào)，這是首次在蛋白組水平上證實(shí) GntR調(diào)控蛋白和AlkB2同時(shí)受烷烴誘導(dǎo)過(guò)量表達(dá)，為單加氧酶調(diào)控機(jī)制的研究提供重要的基礎(chǔ)和線索。此外，差異蛋白涵蓋假單胞菌物質(zhì)攝取和烷烴代謝的完整過(guò)程，特別的，在表達(dá)上調(diào)蛋白中發(fā)現(xiàn)了與趨化性、VI型分泌系統(tǒng)、環(huán)境壓力和調(diào)控等相關(guān)的一系列蛋白，提示當(dāng)烷烴存在時(shí)菌體這些生理活動(dòng)增強(qiáng)，為探索烷烴降解機(jī)制、改造工程菌株提供了新的研究視角。