熒光假單胞菌M18及其rsmA-突變株的電鏡觀察和雙向電泳研究.pdf

1、熒光假單胞菌是一類重要的生防菌，在農(nóng)業(yè)生物防治中有著廣泛的應(yīng)用。本研究所用M18菌株是國(guó)際上首次發(fā)現(xiàn)的能夠同時(shí)產(chǎn)生藤黃綠菌素（Plt）和吩嗪-1-羧酸（PCA）兩種抗生素的假單胞菌株，對(duì)農(nóng)作物病害具有廣泛的抑制作用。次生代謝阻遏蛋白（rsm）A能夠在轉(zhuǎn)錄后水平上，對(duì)細(xì)菌的次生代謝和行為起著全局性調(diào)控作用。rsmA基因被敲除后的rsmA－突變株在King’ B固體培養(yǎng)基、28℃培養(yǎng)36hr的條件下，在菌落的大小和形態(tài)、生長(zhǎng)曲線、Plt和P

2、CA的產(chǎn)量等方面體現(xiàn)出與野生型菌株十分不同的特征；現(xiàn)已知rsmA在大腸桿菌和腸沙門氏桿菌中的同源物CsrA能夠影響細(xì)胞大小和細(xì)胞表面特征，這提示野生型和突變型可能在細(xì)胞大小、形態(tài)結(jié)構(gòu)、蛋白表達(dá)等方面同樣存在某些差異。 本研究的目的在于：1.了解rsmA基因?qū)18細(xì)胞大小、表面特征、內(nèi)部結(jié)構(gòu)的影響。2.了解rsmA基因?qū)?xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的影響，并試圖尋找出與rsmA關(guān)系密切的一些蛋白。 本實(shí)驗(yàn)所用菌株均為King’ B固體

3、培養(yǎng)基、28℃倒置培養(yǎng)36hr。采用掃描電鏡和透射電鏡（負(fù)染、超薄切片）對(duì)野生型和突變型菌體進(jìn)行了觀察。根據(jù)透射電鏡（負(fù)染）的結(jié)果，野生型和突變型分別隨機(jī)測(cè)量30個(gè)菌體的大小，并運(yùn)用SPSS 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行兩獨(dú)立樣本均值的t檢驗(yàn)，以確定兩菌株的菌體大小是否存在明顯差異。本實(shí)驗(yàn)采用Bio-Rad公司pH3-10/7cm、pH5-8/7cm的IPG膠條和PROTEAN 等電聚焦儀、Mini-PROTEAN III型垂直電泳槽進(jìn)行雙向電泳。

4、研究了不同的水化上樣液（ReadyPrep 2-D水化/上樣緩沖液、ReadyPrep蛋白順序抽提試劑III）、不同的SDS-PAGE凝膠濃度（12％、15％）、不同的染色方法（考馬斯亮藍(lán)R250、Bio-Safe考馬斯、熒光染色）對(duì)電泳結(jié)果的影響。根據(jù)優(yōu)化的方法分別構(gòu)建了野生型和突變型pH3-10和pH5-8范圍的雙向電泳圖譜，并運(yùn)用ImageMaster圖像分析軟件進(jìn)行了點(diǎn)檢測(cè)、凝膠匹配、差異點(diǎn)顯示等初步分析。 掃描電鏡和透

5、射電鏡的結(jié)果均顯示，野生型和突變型的細(xì)胞表面特征和內(nèi)部結(jié)構(gòu)存在十分明顯的差異。從掃描電鏡的結(jié)果看，突變型細(xì)胞表面有許多白色小點(diǎn)，使細(xì)胞表面顯得十分粗糙；與此相反，野生型細(xì)胞表面則比較光滑。從負(fù)染和超薄切片的結(jié)果看，突變型的細(xì)胞邊緣存在很多電子密度很低、可能是質(zhì)周體的結(jié)構(gòu)，而這一結(jié)構(gòu)在野生型細(xì)胞中幾乎觀察不到。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的結(jié)果顯示野生型菌體大小為1.71×0.56?m，而突變型為1.35×0.55?m，野生型菌體長(zhǎng)度明顯大于突變型。雙向電

6、泳和圖像分析的結(jié)果顯示，野生型和突變型的蛋白表達(dá)存在一系列明顯的差異。在pH 3-10范圍的電泳圖譜上可見一十分明顯的蛋白點(diǎn)(pI8.17879,MW10767)為野生型所特有。在pH5-8的電泳圖譜中pH5-7范圍的分辨率大大提高，經(jīng)圖像分析，野生型和突變型分別檢出399和374個(gè)蛋白點(diǎn)，匹配率為85.97％，分別有67和42個(gè)蛋白點(diǎn)未能匹配，視為差異點(diǎn)，其中pI6.01632，MW21923的蛋白點(diǎn)為突變型所特有。 在上述結(jié)

7、果的基礎(chǔ)上可得出以下結(jié)論：1.在 King’ B固體培養(yǎng)基、28℃倒置培養(yǎng)36hr的條件下（下同），rsmA基因?qū)晒饧賳伟鶰18的菌體大小有顯著影響，這一基因的缺失使菌體長(zhǎng)度變小。2. rsmA基因影響熒光假單胞菌M18的細(xì)胞表面特征和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，rsmA基因的敲除使細(xì)胞表面由光滑變?yōu)榇植凇?. rsmA基因與熒光假單胞菌M18內(nèi)一系列蛋白的表達(dá)相關(guān)，rsmA基因的缺失使pI6.01632，MW21923的蛋白點(diǎn)出現(xiàn)而pI8.1787