禽致病性大腸桿菌全基因組測序與比較基因組學(xué)分析.pdf

1、禽致病性大腸桿菌（avian pathogenic Escherichia.coli，APEC）為禽大腸桿菌病病原，可引起家禽局部或全身性感染，主要造成家禽敗血癥(sepsis)、心包炎(pericarditis)和氣囊炎(airsacculitis)等，該病原菌在世界范圍內(nèi)的流行對家禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，雖然很多與APEC菌株致病力相關(guān)的毒力因子已經(jīng)被報(bào)道，但是，不同來源和不同致病型菌株之間基因組的多樣性和頻繁的轉(zhuǎn)座事件及基因

2、的水平轉(zhuǎn)移，為APEC的致病機(jī)制研究帶來很多困難。當(dāng)前，關(guān)于APEC的致病機(jī)制仍不甚清楚。
　　隨著第二代高通量測序技術(shù)的普及和第三代測序技術(shù)的開發(fā)，測序成本越來越低，獲得序列信息的病原微生物越來越多，為揭示病原微生物的致病機(jī)制及其規(guī)律提供了新的行之有效的方法。目前，NCBI基因組數(shù)據(jù)庫中只有2株APEC的全基因組序列信息，對APEC菌株的全基因組信息了解還比較少，為了更好地研究禽致病性大腸桿菌的遺傳規(guī)律和致病機(jī)制，我們選取了2株

3、APEC優(yōu)勢血清型O78血清型菌株，進(jìn)行了全基因組的測序和比較基因組分析的研究，主要研究內(nèi)容包括:
　　1.禽致病性大腸桿菌全基因組測序
　　本研究中利用Roche公司454GS-FLX測序平臺對2株APEC菌株ACN001和ACN002進(jìn)行全基因組序列的測定，并對其基因組缺口進(jìn)行了人工修補(bǔ)和序列拼裝注釋，獲得兩個(gè)環(huán)狀基因組序列。其中，ACN001的基因組大小為4，936，576bp，測序覆蓋度為23.6，預(yù)測編碼基因有47

4、94個(gè)，基因組平均GC含量為50.67％，7套16s-23s-5s核糖體rRNA操縱子，86個(gè)tRNA;ACN002的基因組大小為4，879，931bp，測序覆蓋度為35.8，預(yù)測編碼基因有4677個(gè)，基因組平均GC含量為50.69％，7套16s-23s-5s核糖體rRNA操縱子，85個(gè)tRNA。除此以外，ACN001和ACN002菌株中分別含有6和7個(gè)質(zhì)粒，其中包括毒力質(zhì)粒和多重耐藥質(zhì)粒。同時(shí)，我們還對兩菌株的插入序列、噬菌體相關(guān)編碼

5、基因等基本特征進(jìn)行了預(yù)測分析，在ACN001和ACN002的染色體基因組中，分別預(yù)測到了39和37個(gè)可信的IS元件，同時(shí)分別預(yù)測到8和6個(gè)簇狀排列的原噬菌體區(qū)域，這些原噬菌體區(qū)域中都包括了結(jié)合位點(diǎn)、整合酶、轉(zhuǎn)座酶、tRNA以及噬菌體組裝相關(guān)等基因。
　　2.禽致病性大腸桿菌比較基因組學(xué)分析
　　將本研究中2株完整測序的菌株ACN001和ACN002進(jìn)行全基因組共線性比較分析，結(jié)果表明ACN001與ACN002的基因組共線性較

6、好，我們共發(fā)現(xiàn)并定位了7處存在于ACN001與ACN002之間的插入或缺失序列，以及2處發(fā)生移位的片段。根據(jù)功能注釋結(jié)果推測，這些插入缺失區(qū)域都是噬菌體水平轉(zhuǎn)移而來。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，ACN002基因組相較于ACN001基因組，存在一段長約685kb的大片段倒位區(qū)，我們對倒位以及插入缺失的差異區(qū)域進(jìn)行生物學(xué)功能分析，發(fā)現(xiàn)黏附素編碼基因aidA和鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)跨膜蛋白編碼基因tonB在ACN001基因組中是完整的，而在ACN002基因組中卻是不完

7、整的。同時(shí)，我們比較和分析了ACN001和ACN002菌株在毒力質(zhì)粒、耐藥質(zhì)粒、鐵攝取系統(tǒng)、鞭毛基因簇和Ⅰ型菌毛基因簇上的異同，發(fā)現(xiàn)ACN001和ACN002的基因組在Ⅰ型菌毛fim基因簇、鐵攝取相關(guān)的耶爾森菌素Ybt系統(tǒng)、鞭毛flg基因簇、毒力質(zhì)粒和耐藥質(zhì)粒上都存在著一定的差異。通過以上分析，從基因水平上闡釋了兩者致病性差異的分子基礎(chǔ)，為進(jìn)一步探究APEC的遺傳規(guī)律和致病機(jī)制提供依據(jù)。
　　我們將ACN001和ACN002與NC

8、BI基因組數(shù)據(jù)庫中已公布的APECO1（GenBank登錄號:NC_008563）和APECO78（GenBank登錄號:CP004009）進(jìn)行同源基因聚類(orthologous)分析，獲得了5739個(gè)基因簇，其中，4株菌株共有的基因簇即核心基因簇(core-genome)有3246個(gè)，占總基因簇的56.56％。發(fā)現(xiàn)同為O78血清型B1群系的ACN001、ACN002和APECO78所共有的基因簇（689個(gè)）明顯多于其他組合，APEC

9、O1與另外3株菌株中任意一株所共有的基因簇總是少于其他組合。在分析各個(gè)菌株所特有的基因簇時(shí)，發(fā)現(xiàn)APECO1所特有的基因簇是最多的（723個(gè)），明顯多于其他菌株。結(jié)果表明ACN001、ACN002與APECO78進(jìn)化關(guān)系較近，而與APECO1菌株的進(jìn)化關(guān)系則較遠(yuǎn)。
　　3.禽致病性大腸桿菌基因組進(jìn)化分析
　　本研究中，我們共選取了包括ACN001和ACN002在內(nèi)的48株大腸桿菌基因組序列、5株志賀氏菌和1株費(fèi)格森埃希菌序列