miR-135a和miR-183對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化及脂肪形成的調(diào)控作用研究.pdf

1、本論文旨在研究miRNA對(duì)脂肪細(xì)胞分化的影響，探討miRNA調(diào)控脂肪細(xì)胞分化和脂肪形成的分子機(jī)制。我們以5月齡大白豬和梅山豬的背部脂肪組織為研究對(duì)象，分別構(gòu)建背部脂肪組織的小RNA文庫(kù)，應(yīng)用高通量的Solexa測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析軟件鑒定大白豬和梅山豬背部脂肪組織的miRNAs，并進(jìn)行差異表達(dá)和預(yù)測(cè)新的miRNAs等一系列分析。對(duì)這些差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行了鑒定、靶基因預(yù)測(cè)和功能分析，從中篩選與脂肪細(xì)胞分化、脂肪形成和脂肪代謝潛

2、在相關(guān)的miRNAs。預(yù)測(cè)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-135a和miR-183可能通過(guò)調(diào)控經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)影響脂肪的形成。據(jù)此，本研究通過(guò)合成寡核苷酸片段miRNAmimics和miRNAinhibitor分別模擬“功能獲得”和“功能缺失”來(lái)研究miRNAs對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞的甘油三酯含量和分化標(biāo)記基因表達(dá)水平的影響，并通過(guò)雙熒素酶報(bào)告基因檢測(cè)、QPCR及Westemblotting分析來(lái)證實(shí)預(yù)測(cè)的靶基因。最后，通

3、過(guò)生物信息學(xué)軟件對(duì)小鼠miR-183的側(cè)翼序列進(jìn)行預(yù)測(cè)、分離并克隆其核心啟動(dòng)子、ChIP-PCR試驗(yàn)證實(shí)GATA3是小鼠mir-183的轉(zhuǎn)錄因子，GATA3與mir-183核心啟動(dòng)子的結(jié)合可能負(fù)調(diào)控pri-miR-183的轉(zhuǎn)錄從而抑制成熟miR-183的表達(dá)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.豬背部脂肪組織miRNAs的篩選和鑒定
　　 Solexa高通量測(cè)序分析結(jié)果發(fā)現(xiàn):①在大白豬和梅山豬的背部脂肪組織樣品中分別獲得21，

4、911，830和22，384，940條小RNA原始序列，其中高質(zhì)量序列各為19，510，268和19，952，323條，分別占小RNA序列的89.04％和89.13％。得到的純凈小RNA讀數(shù)(cleanreads)分別為19，271，999條（占高質(zhì)量序列的98.78％）和19，613，350條（占高質(zhì)量序列的98.30％）。②在兩樣品庫(kù)中共鑒定出121個(gè)成熟miRNAs，包括72個(gè)已知的豬miRNAs和49個(gè)同源的豬中新的miRNA*

5、。在9個(gè)差異表達(dá)顯著的保守miRNAs，ssc-miR-135、ssc-miR-224、ssc-miR-146b和ssc-miR-215在大白豬中高表達(dá)，而ssc-miR-1a、ssc-miR-122、ssc-miR-133a、ssc-miR-183和ssc-miR-204則在梅山豬中高表達(dá)。③在兩樣品庫(kù)中共發(fā)現(xiàn)了140個(gè)新的候選miRNAs（對(duì)應(yīng)156個(gè)基因組位點(diǎn)），大白豬樣品中87個(gè)，梅山豬樣品中102個(gè)。其中miR-1343、mi

6、R-2320、miR-2326、miR-2411和miR-2483只與牛同源保守，其他都是豬特異的miRNAs。
　　 2.豬背部脂肪組織miRNAs的表達(dá)分析和功能預(yù)測(cè)
　　 對(duì)6個(gè)差異表達(dá)顯著的保守miRNAs及4個(gè)新的候選miRNAs進(jìn)行stem-loopQPCR試驗(yàn)驗(yàn)證。分析結(jié)果顯示，除miR-1a以外，其余miRNAs的表達(dá)趨勢(shì)與Solexa測(cè)序結(jié)果一致。
　　 多種靶基因軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，小鼠的miR

7、-135a與APC基因的3'UTR具有兩個(gè)潛在的結(jié)合位點(diǎn);GSK3β也可能是miR-135a的靶標(biāo);LRP6是miR-183的潛在靶基因。KEGG軟件分析結(jié)果表明APC、GSK3β和LRP6是經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的重要成員。據(jù)此推測(cè)，miR-135a和miR-183有可能分別通過(guò)靶向作用APC、GSK3β和LRP6參與經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)調(diào)控脂肪的形成。
　　 3.miR-135a對(duì)3T

8、3-L1前脂肪細(xì)胞的分化及脂肪形成的影響
　　 與未分化的3T3-L1前脂肪細(xì)胞相比，成脂誘導(dǎo)分化過(guò)程中miR-135a的表達(dá)水平降低了約3倍。miR-135a處理組細(xì)胞的甘油三酯含量低于對(duì)照組，同時(shí)脂肪細(xì)胞分化標(biāo)記基因(PPARγ、C/EBPα、ap2和FAS)的表達(dá)水平也降低。
　　 采用多種方法對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因APC進(jìn)行驗(yàn)證:與對(duì)照組相比，miR-135a顯著抑制APC3'UTR載體的熒光活性(p＜0.01)。miR

9、-135a抑制3T3-L1細(xì)胞內(nèi)源APCmRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。反之，抑制miR-135a的表達(dá)，3T3-L1細(xì)胞中的APC蛋白的表達(dá)量升高。miR-135a提高經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路CCND1和c-myc的mRNA及細(xì)胞核中β-catenin蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。因此，miR-135a通過(guò)靶向作用APC基因，激活經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化和脂肪形成。
　　 4

10、.miR-183對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中脂肪形成的影響
　　 誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化后的第2天和第4天，轉(zhuǎn)染miR-183組的脂肪細(xì)胞分化標(biāo)記基因(C/EBPα、PPARγ、adiponectin和FAS)的mRNA表達(dá)量高于對(duì)照組。誘導(dǎo)5天的3T3-L1脂肪細(xì)胞的分析結(jié)果顯示，miR-183組細(xì)胞較對(duì)照組的脂滴多、甘油三酯含量高(p＜0.05)。另外，miR-183inhibitor抑制脂肪細(xì)胞分化標(biāo)記基因P

11、PARγ和C/EBPα的表達(dá)及甘油三酯的積累。
　　 對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因LRP6進(jìn)行驗(yàn)證:與對(duì)照相比，miR-183顯著抑制LRP63'UTR載體的熒光活性(p＜0.01)。miR-183抑制3T3-L1細(xì)胞內(nèi)源LRP6mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。miR-183抑制經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路c-myc的mRNA及細(xì)胞核中β-catenin的表達(dá)水平。因此，miR-183通過(guò)靶向結(jié)合LRP6，抑制經(jīng)典的Wnt/β-cate

12、nin信號(hào)通路的激活，從而促進(jìn)脂肪形成。
　　 5.小鼠mir-183啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性研究
　　 多種在線網(wǎng)站和軟件對(duì)小鼠mir-183的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，mir-183上游存在多個(gè)CpG島、有可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和眾多的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，miR-183側(cè)翼序列存在多個(gè)EST數(shù)據(jù)報(bào)告。據(jù)此推測(cè)mir-183很有可能存在獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單元。
　　 分兩段擴(kuò)增miR-183上游5kb的區(qū)域，即無(wú)CpG島的promoter1及其

13、上游含多個(gè)CpG島的promoter2片段。結(jié)果表明，pGL3-mir-183promoter1無(wú)熒光活性，而pGL3-mir-183promoter2的熒光活性則極顯著增強(qiáng)(p＜0.01)。進(jìn)一步分析結(jié)果顯示promoter2片段5'端的176bp區(qū)域能夠極顯著增強(qiáng)細(xì)胞熒光活性(p＜0.01)，其可能是mir-183的核心啟動(dòng)子區(qū)域。TFSEARCH和TESS軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)核心啟動(dòng)子中與脂肪形成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子sp1和GATA3。試驗(yàn)結(jié)果

14、表明，GATA3轉(zhuǎn)錄因子極顯著降低核心啟動(dòng)子的熒光活性(p＜0.01)。與正常核心啟動(dòng)子相比，GATA3結(jié)合位點(diǎn)突變的核心啟動(dòng)子活性顯著增強(qiáng)(p＜0.05)。另外，GATA3轉(zhuǎn)錄因子抑制成熟miR-183的表達(dá)量，ChIP-PCR試驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子GATA3與mir-183核心啟動(dòng)子的結(jié)合。以上試驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄因子GATA3與小鼠mir-183核心啟動(dòng)子的結(jié)合可能抑制pri-miR-183的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致成熟miR-183的表達(dá)量下降。<

15、br>　　 結(jié)論:①鑒定了更多的豬miRNAs，極大地豐富了豬的miRNA數(shù)據(jù)庫(kù);試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果與Solexa測(cè)序結(jié)果基本一致，說(shuō)明高通量Solexa測(cè)序方法的結(jié)果精確、真實(shí)可靠。②miR-135a通過(guò)直接靶向作用APC基因，促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)中β-catenin蛋白的轉(zhuǎn)位入核，激活經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路，抑制甘油三酯的積累和脂肪細(xì)胞分化標(biāo)記基因的表達(dá)，從而阻礙3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化和脂肪形成。③miR-183通過(guò)靶向結(jié)