H1N1豬流感病毒與豬鏈球菌2型混合感染仔豬肺組織的基因表達(dá)譜分析.pdf

1、豬流感病毒(SIV)與豬鏈球菌2型(SS2)均為重要的呼吸道病原，兩者混合感染所引起的豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)在臨床中普遍存在，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。迄今為止，這兩種病原的致病機(jī)制以及混合感染的協(xié)同致病機(jī)制仍不清楚，尚無有效的防治措施。本研究以仔豬為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物構(gòu)建H1N1豬流感病毒與豬鏈球菌2型混合感染模型，利用基因芯片揭示單獨(dú)感染與混合感染后仔豬肺組織的基因表達(dá)譜，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，旨在探討單獨(dú)感染與混合感染在致病

2、機(jī)制上的異同，為疫情的防制進(jìn)行有益探索。
　　 1.仔豬H1N1豬流感病毒-豬鏈球菌2型混合感染模型建立
　　 在人工感染試驗(yàn)中，12頭經(jīng)檢測SIV病原與抗體陰性、SS2抗體陰性仔豬隨機(jī)分為4組，每組3頭。實(shí)驗(yàn)第1天，SIV組和SIV-SS2組的仔豬鼻腔接種H1N1病毒液，同時(shí)空白對(duì)照組和SS2組使用DMEM進(jìn)行相同處理。實(shí)驗(yàn)第4天，各組仔豬經(jīng)2%冰醋酸溶液滴鼻處理30分鐘后，SS2組和SIV-SS2組的仔豬鼻腔接種SS

3、2細(xì)菌液，同時(shí)空白對(duì)照組和SIV組使用PBS進(jìn)行相同處理。實(shí)驗(yàn)第6天，解剖各組仔豬觀察臟器病變、采集樣品(提取總RNA、分離鑒定病原、制作病理切片)。自實(shí)驗(yàn)開始，每天監(jiān)測仔豬的體溫、臨床表現(xiàn)，隔天采集鼻拭子。研究結(jié)果顯示：相對(duì)于單獨(dú)感染，H1N1豬流感病毒與豬鏈球菌2型混合感染可引起更嚴(yán)重的體溫紊亂、更多樣的臨床癥狀，范圍更廣、程度更深的剖檢病變和組織病變；同時(shí)豬鏈球菌2型可能有助于H1N1豬流感病毒的增殖，使豬流感的感染癥狀持續(xù)更長的

4、時(shí)間。
　　 2.仔豬H1N1豬流感病毒-豬鏈球菌2型混合感染基因表達(dá)譜分析
　　 利用從上述模型構(gòu)建中采集的各組肺臟樣品，抽提總RNA，經(jīng)純化、反轉(zhuǎn)錄、標(biāo)記后與Agilent4×44K Porcine Oligo Microarray雜交。芯片原始數(shù)據(jù)經(jīng)扣本底和歸一化處理后，采用一維方差分析法(one way ANOVA)對(duì)組間差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以組間差異倍數(shù)(Fc)≥1.5，且q-value<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異

5、表達(dá)探針。結(jié)果顯示：SIV組、SS2組、SIV-SS2組分別有1314、1354、2652個(gè)差異表達(dá)探針，對(duì)應(yīng)444、411、844個(gè)差異表達(dá)基因。以Biological process為分類依據(jù)對(duì)各組差異表達(dá)基因進(jìn)行Gene Ontology分析，結(jié)果顯示SIV組、SS2組、SIV-SS2組的差異表達(dá)基因主要參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)、轉(zhuǎn)錄(transcription)、發(fā)育(development)、免疫

6、應(yīng)答(immune response)、細(xì)胞粘附(cell adhesion)、炎性反應(yīng)(inflammatoryresponse)、凋亡(apoptosis)、天然免疫應(yīng)答(innate immune response)等生物過程。以Kegg為數(shù)據(jù)庫對(duì)各組差異表達(dá)基因進(jìn)行pathway分析，結(jié)果顯示SIV組、SS2組、SIV-SS2組的差異表達(dá)基因主要涉及細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體互作(Cytokine-cytokine receptor

7、 interaction)、Toll樣受體途徑(Toll-like receptor signalingpathway)、MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)、凋亡(Apoptosis)、補(bǔ)體途徑(Complement and coagulation cascades)、細(xì)胞粘附分子(Cell adhesionmolecules)、天然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(Natural killer cell medi