熱處理結(jié)合化學(xué)處理脫除梨病毒研究及熱處理植株中病毒siRNAs鑒定.pdf

1、病毒危害可嚴(yán)重影響梨生長勢和降低果品產(chǎn)量與品質(zhì)，栽培無病毒種苗是減輕梨病毒病危害的重要途徑，熱處理和化學(xué)處理是獲得無病毒果樹種質(zhì)的主要方法。大量的研究表明持續(xù)高溫或采用一定濃度的病毒抑制劑處理可以脫除植物病毒，但梨對高溫相對敏感，長時間的高溫處理易造成梨植株的大量死亡，化學(xué)處理也可導(dǎo)致梨植株產(chǎn)生藥害，同時需要較長的處理周期。本研究以感染有蘋果莖溝病毒(Applestem grooving virus，ASGV)和蘋果褪綠葉斑病毒(App

2、le chlorotic leaf spot virus，ACLSV)的砂梨“金水2號”離體植株為試驗材料，采用熱處理(35℃)與化學(xué)處理(病毒醚)相結(jié)合的方法進(jìn)行梨病毒脫除的研究，以期提高病毒脫除效果。同時對繼代培養(yǎng)過程中梨離體植株的ASGV分子群體結(jié)構(gòu)特點進(jìn)行了系統(tǒng)分析，測定了一個ASGV砂梨分離物的全長基因組序列。并以熱處理的砂梨離體植株為材料，采用高通量測序方法分析了該植株中ASGV的siRNA組成特點，定量分析了其在熱處理35

3、 d過程中的含量變化。結(jié)果如下：
　　 1.以砂梨“黃花”離體植株為研究材料，采用RT-PCR技術(shù)對ASGV進(jìn)行檢測的結(jié)果表明，該病毒在20次繼代培養(yǎng)的“黃花”離體植株中可以穩(wěn)定增殖。對擴增產(chǎn)物進(jìn)行克隆，每次繼代的植株中挑選大于20個克隆的單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析的結(jié)果顯示，“黃花”離體植株中存在ASGV的一個優(yōu)勢分子變種，繼代培養(yǎng)對ASGV的分子群體結(jié)構(gòu)沒有明顯影響。
　　 2.根據(jù)GenBank登錄序列設(shè)計合成

4、引物，對來源于砂梨“黃花”離體植株的ASGV的全基因組進(jìn)行了擴增和序列分析，該分離物的全基因組(除去聚合A尾)由6496個核苷酸組成(命名為ASGV-HH)，包含兩個開放閱讀框(ORF)，分別編碼241 kDa聚合蛋白和36 kDa運動蛋白。全基因組序列與已報道的來源于日本的蘋果分離物ASGV-P-209，日本的百合分離物CTLV-L和CTLV-Li-23，韓國的砂梨分離物ASGV-P，臺灣的柑橘分離物CTLV-K和CTLV-LCd-N

5、A-1，以及美國的柑橘分離物CTLV-ML的相似性為79.8-87.1%，其中，ASGV-HH的復(fù)制酶編碼區(qū)序列與日本的蘋果分離物ASGV-P-209相似性最高，核苷酸和氨基酸現(xiàn)相似性分別為86.2%和89.9%，其CP和MP的核苷酸序列則與來源于日本的百合分離物CTLV-L同源性最高，分別為93.7%和87.6%。根據(jù)該病毒的可變區(qū)Ⅱ的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，ASGV-HH與CTLV-L親緣關(guān)系最近，而與來源于韓國的梨分離物AS

6、GV-P親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
　　 3.以感染ASGV和ACLSV的砂梨“金水2號”離體植株為研究材料，比較分析了熱處理(35℃)、化學(xué)處理(病毒醚)及二者相結(jié)合對梨離體植株生長的影響及脫除這兩種病毒的效果，結(jié)果顯示15-25μg/ml病毒醚處理5-30 d對梨離體植株的生長和增殖有明顯的促進(jìn)作用，株高由未處理植株的2.10 cm增加至2.57-2.61 cm，增殖系數(shù)由未處理植株的3.27增加至4.09-8.82。分別于處理30 d

7、、35 d和40 d切取0.5 mm和1 mm的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)，繼代1-2次后采用RT-PCR的方法對再生植株的帶毒情況進(jìn)行檢測，結(jié)果表明化學(xué)處理與熱處理相結(jié)合可明顯提高病毒脫除效果，采用15μg/mL和20μg/mL病毒醚結(jié)合35℃處理40 d所獲再生植株的ACLSV和ASGV脫除率分別由病毒醚單獨處理的50.0-60.0%和41.7-50.0%提高至61.5-69.2%和53.8-76.9%，采用25μg/mL病毒醚結(jié)合35℃處理40

8、 d后切取的0.5-1.0 mm莖尖所獲再生植株的病毒脫除率達(dá)100%。采用該方法對“圓黃梨”、“黃花梨”、“雪花梨”和蘋果“潮南”離體植株進(jìn)行了處理，脫病毒率“圓黃梨”和蘋果的為100.0%，“黃花梨”和“雪花梨”的分別為84.6%和64.8%。
　　 4.采用高通量測序方法對經(jīng)熱處理的砂梨“黃花”離體植株中小分子RNA進(jìn)行了鑒定，共測得16，372，275種，其中與ASGV-HH序列匹配的siRNA有3111種(簡稱vsiR

9、NA)，這些vsiRNA的大小在18-25 nt，21 nt和22 nt所占比例最大，占總數(shù)的82.7%。各vsiRNA的出現(xiàn)頻率為1-103次。vsiRNA在ASGV-HH基因組的正負(fù)鏈上的分布有一定的偏向性，在正鏈上分布頻率較高，為55.8%。根據(jù)vsiRNA所對應(yīng)ASGV-HH基因組序列，選取與ASGV基因組6個保守結(jié)構(gòu)域的對應(yīng)的6個vsiRNAs，采用定量RT-PCR(qRT-PCR)分析其在熱處理梨植株中相對含量的時間動態(tài)變化

10、，結(jié)果表明各vsiRNA的含量在熱處理初期呈明顯下降趨勢，而至25 d時均出現(xiàn)一個峰值。其中，對應(yīng)Met、Het、P-Pro和MP的vsiRNA在熱處理25 d植株中的含量較處理前的植株低，而對應(yīng)CP和Rdrp的vsiRNA在熱處理25 d植株中的含量明顯高于處理前的植株，分別為處理前的1.3和2.5倍。ASGV的含量隨熱處理時間的延長呈明顯的下降趨勢，第5d即開始減低，至第25 d時病毒RT-PCR產(chǎn)物的擴增條帶已經(jīng)極其微弱，推測高溫