櫟皮黃酮處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫除砂梨植株中潛隱病毒研究.pdf

1、蘋果褪綠葉斑病毒(Applechloroticleafspotvirus，ACLSV)、蘋果莖溝病毒(Applestemgroovingvirus，ASGV)和蘋果莖痘病毒(Applestempittingvirus，ASPV)是梨樹上重要的潛隱病毒，廣泛分布于世界各梨、蘋果種植區(qū)。在梨樹上潛隱病毒通常不產(chǎn)生明顯的癥狀，但影響樹勢(shì)和降低產(chǎn)量。培育和栽培無病毒種苗是降低蘋果和梨樹病毒危害的最有效途徑。化學(xué)處理是獲得脫病毒種質(zhì)的重要途徑之一

2、。本研究通過改進(jìn)處理方法，分析了櫟皮黃酮處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)技術(shù)脫除梨樹上3種主要潛隱病毒的效果，初步探索了砂梨離體植株生根技術(shù)，具體研究結(jié)果如下： 1.采用RT-PCR技術(shù)，對(duì)黃花和金水2號(hào)兩個(gè)品種的離體培養(yǎng)植株中ACLSV、ASGV和ASPV3種病毒進(jìn)行了檢測(cè)，篩選出帶有這3種病毒的離體植株，通過在MS繼代培養(yǎng)基上擴(kuò)繁，獲得脫病毒處理材料。 2.采用斑點(diǎn)雜交檢測(cè)技術(shù)分析了25μg/ml水溶液直接浸泡預(yù)處理處理金水2號(hào)、金

3、水1號(hào)和黃花帶毒離體植株，對(duì)ACLSV、ASGV和ASPV的濃度的影響，結(jié)果顯示，在處理2d后的離體植株中這3種病毒的雜交檢測(cè)信號(hào)與未處理的帶病毒離體植株無明顯差別；而處理3d后，這3種病毒的雜交信號(hào)均未處理的帶毒離體植株的雜交信號(hào)明顯降低。 3.采用25μg/ml和35μg/ml兩種濃度的櫟皮黃酮水溶液處理分別預(yù)處理3d和4d后，轉(zhuǎn)入含有相應(yīng)濃度櫟皮黃酮的MS培養(yǎng)基中繼續(xù)處理45d、50d、55d和60d，分別切取2mm、1m

4、m和0.5mm大小的莖尖接種到MS培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)一次，采用PAS-ELISA法檢測(cè)所獲再生植株中ACLSV、ASGV和ASPV3種病毒含量的相對(duì)變化，結(jié)果表明，預(yù)處理3d和4d，再在含25μg/ml和35μg/ml櫟皮黃酮的MS培養(yǎng)基中處理至第45后，3種病毒檢測(cè)吸光值均有明顯的下降，其中，ACLSV濃度在第55d和第60d下降最明顯，以蒸餾水和已二醇單乙醚作相同處理的對(duì)照植株中，ELISA檢測(cè)吸光值無明顯差異。采用斑點(diǎn)雜交進(jìn)一步檢測(cè)

5、各處理的脫病毒效果，檢測(cè)的病毒包括ACLSV和ASPV，結(jié)果顯示，用25μg/ml和35μg/ml櫟皮黃酮處理50d和55d后取0.5mm莖尖再培養(yǎng)所獲離體植株，無論預(yù)處理3d或4d，ACLSV、ASPV雜交信號(hào)均有明顯的降低。用25μg/ml櫟皮黃酮處理60后取0.5mm莖尖及35μg/ml櫟皮黃酮預(yù)處理4d后在含同濃度的櫟皮黃酮培養(yǎng)55d取0.5mm獲得的再生植株基本均無雜交信號(hào)。從檢測(cè)結(jié)果還可看出，用濃度為35μg/ml櫟皮黃酮處

6、理較濃度為25μg/ml櫟皮黃酮處理可降低雜交信號(hào)，但不能縮短完全脫毒所需時(shí)間；延長(zhǎng)預(yù)處理時(shí)間至4d時(shí)，可縮短含櫟皮黃酮培養(yǎng)基處理時(shí)間；所取莖尖大小對(duì)櫟皮黃酮處理后的脫毒效果影響很明顯，當(dāng)所取莖尖為1mm時(shí)，處理60d后的再生植株中這兩種病毒仍有較強(qiáng)的雜交信號(hào)。 4.設(shè)計(jì)不同的生根培養(yǎng)基對(duì)5-6-45、金水2號(hào)和豐水三個(gè)品種進(jìn)行生根試驗(yàn)，結(jié)果顯示，5-6-45和金水2號(hào)在生根培養(yǎng)基1/2MS+2.0mg/LIBA+1.5mg/L