兩種線狀病毒分子變異的研究及熱處理對梨基因表達(dá)的影響.pdf

1、本研究對來源于中國的砂梨和加拿大溫室與作物加工研究中心國家種質(zhì)資源圃蘋果和西洋梨的蘋果褪綠葉斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus ACLSV）分離物和核果類上的櫻桃綠環(huán)斑駁病毒（Cherry green ring mottle virus，CGRMV）分子變異進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，明確了蘋果褪綠葉斑病毒和櫻桃綠環(huán)斑駁病毒的分子變異情況以及進(jìn)化上的親緣關(guān)系，為蘋果、梨和核果類病毒的發(fā)生、防治奠定了基礎(chǔ)。栽培

2、無病毒種苗是減輕這些病毒危害的重要途徑，熱處理技術(shù)也廣泛應(yīng)用于無病毒果樹種質(zhì)培育中。為探索適合梨病毒的脫毒處理?xiàng)l件，建立更加有效的脫毒技術(shù)，本研究分析了熱處理對病毒在離體植株中分布的影響，結(jié)果表明高溫降低莖尖病毒濃度，對基部無影響，這種作用的不均勻性是否觸發(fā)了熱處理的某些抗性機(jī)制仍不清楚，進(jìn)而以熱處理和正常培養(yǎng)砂梨離體植株為研究體系，構(gòu)建cDNA差減文庫，篩選熱處理誘導(dǎo)下與病毒互作的相關(guān)基因，深入分析熱處理對病毒生活史及植物基因表達(dá)解析

3、熱處理脫除機(jī)制。取得的主要研究結(jié)果如下：
　　 1.本研究采用生物學(xué)法和RT-PCR對加拿大溫室與作物加工研究中心國家種質(zhì)資源圃核果類110個樣品檢測，結(jié)果表明8個樣品感染CGRMV，并首次發(fā)現(xiàn)了CGRMV侵染李寄主。對擴(kuò)增的8個CGRMV分離物的CP基因編碼的氨基酸進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明CP基因變異很大，分離物之間的氨基酸同源性為90～100％，在進(jìn)化親緣關(guān)系上CGRMV分離物可以分為兩個組群。
　　 2.加拿大溫室與

4、農(nóng)作物加工研究中心的國家種質(zhì)資源圃梨和蘋果四種主要病毒的檢測結(jié)果，采用DAS-ELISA對采集的438份蘋果和122份梨樣品進(jìn)行四種主要病毒ACLSV、蘋果莖溝病毒（Apple stem grooving virus，ASGV）、蘋果莖痘病毒（Aple stem pitting virus，ASPV）和蘋果花葉病毒（Apple mottle virus，ApMV）進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，病毒復(fù)合感染現(xiàn)象普遍，其中ACLSV發(fā)生最普遍，其檢出

5、率達(dá)40％左右，梨樣品嚴(yán)重感染了ASPV和ApMV，帶毒率高于90％。以總RNA為模板，在檢測體系中引入nad5基因作為內(nèi)標(biāo)的多重RT-PCR對17份蘋果樣品的四種主要病毒進(jìn)行復(fù)檢，均能擴(kuò)增四種病毒的特異性目標(biāo)片斷，檢測效果較ELISA好。
　　 3.ACLSV3'端基因的分子變異研究，以ACLSV-6860/ACLSV-7536為引物，采用改進(jìn)的CTAB法提取總RNA為模板的RT-PCR對來源于加拿大22個.ACLSV分離物和

6、采用TC-RT-PCR法病毒粗提液為模板對來源于中國24個ACLSV分離物的3'端基因進(jìn)行擴(kuò)增、純化、克隆和測序。序列測定表明，目標(biāo)片斷大小為680bp左右，該序列包含3'端CP基因（500nt，占CP核苷酸序列的85％）和3'端NCR.序列。對加拿大22個ACLSV分離物的擴(kuò)增片斷進(jìn)行了序列分析，結(jié)果表明，22個ACLSV分離物的核苷酸序列同源性為84～100％，其中11個分離物序列同源性為100％。參照報(bào)道來源于不同國家不同寄主的A

7、CLSV分離物的序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析，加拿大ACLSV分離物分為2個組群，分離物Malus0422、Malus0908和Malus0422與來源日本P205位于同一組群，屬于P205型，CP基因編碼的氨基酸具有Ala14-Va133-Phe49-Ser104-Met158的保守序列特點(diǎn)，其余19個分離物位于另一個組群的兩個不同分支，屬于B6型，CP氨基酸具有保守序列Ser14-Leu33-Tyr49-Thr104-Leu158的特點(diǎn)。對來

8、源于中國砂梨的20個分離物和來源于蘋果和桃子上的4個分離物與Genbank上登錄的來源于不同國家和不同寄主的分離物序列進(jìn)行同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，本研究的24個ACLSV分離物屬于B6型，進(jìn)化樹分析分為兩個組群，兩組群之間苷酸和氨基酸同源性為86.3～87.5％和94.0～96.4％。擴(kuò)增片斷為686bp、來源于砂梨的的XSJ，SMJ，QX，PL，CL，QYS，GY和蘋果C-AP之間同源性為95～99％的8個分離物，親緣關(guān)系較近在進(jìn)

9、化樹中歸為為同一組群；擴(kuò)增片斷為680bp，來源于砂梨ZY，JS1,ZSZ，HL1,JQ，F(xiàn)S，SY，BY61-7-7，CX，CS和1個桃子C-P之間同源性為96～100％的12個分離物與來源于砂梨的XG、HL2和2個桃子（C-XA和C-HB）之間同源性為95～99％，位于另一個組群的兩個不同進(jìn)化分支。采用PCR-SSCP技術(shù)對中國砂梨的9個樣品進(jìn)行了ACLSV分子變異分析，結(jié)果表明同源性高于98％位于同一組群的的ZY、ZSZ、HL1、

10、FS、JS1、JQ分離物的SSCP電泳為帶型一致的兩條彌散帶型，位于另一組群同源性為99％的C-XA和HL2分離物的SSCP電泳為泳動帶型一致的兩條彌散帶型。對分離物ZY、JQ和CL多個克隆進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明，ACLSV每個分離物由不同分子變種組成，其中有一個優(yōu)勢變種；優(yōu)勢變種和非優(yōu)勢變種序列間僅幾個堿基差異，相似性高達(dá)99～100％，說明分離物內(nèi)部存在遺傳變異，ZY和JQ兩個分離物的克隆序列進(jìn)行多重比對，結(jié)果表明兩個分離物的優(yōu)勢變

11、種的序列同源性為100％。
　　 4.熱處理對梨離體植株中ACLSV和ASGV分布的影響，本研究對比組織印跡雜交的兩種化學(xué)顯色方法檢測病毒核酸產(chǎn)生的雜交信號強(qiáng)度，CDP-Star底物化學(xué)發(fā)光檢測產(chǎn)生的雜交信號強(qiáng)于NBT/BCIP底物化學(xué)顯色，但信號相對較弱的NBT/BCIP底物化學(xué)顯色，既具有常規(guī)雜交技術(shù)的特異性，又可以直接觀察病毒在梨離體植株中的分布狀況，進(jìn)而采用組織印跡結(jié)合化學(xué)發(fā)光顯色法對熱處理過程中ACLSV和ASGV在砂

12、梨離體植株自莖尖到基部每隔0.5mm橫切面的動態(tài)分布變化進(jìn)行分析，結(jié)果表明，熱處理50d后病毒濃度開始降低，植株莖尖無病毒核酸分布，莖干中部病毒核酸也明顯下降，而莖干基部仍產(chǎn)生強(qiáng)的雜交信號，根據(jù)雜交信號的有無判斷，可以觀察到在莖尖2mm無雜交信號，表明獲得了莖尖2mm的無毒植株，對耐熱性高的ASGV病毒，在莖尖0.5mm無雜交信號，得到了莖尖0.5mm無ASGV區(qū)域，因此采用組織印跡對熱處理材料進(jìn)行病毒分布分析，直接提供熱處理50d后切

13、0.5mm和2mm莖尖繼代離體培養(yǎng)可以有效脫除ASGV和ACLSV的信息。
　　 5.熱處理誘導(dǎo)寄主基因差異表達(dá)，以37℃恒溫?zé)崽幚砗驼Ｅ囵B(yǎng)的帶有ASGV和ACLSV的黃花梨離體培養(yǎng)植株為研究體系，利用抑制差減雜交技術(shù)（SSH）構(gòu)建了熱處理誘導(dǎo)寄主上調(diào)和下調(diào)基因文庫。通過反向Southern斑點(diǎn)雜交技術(shù)對兩個差減文庫進(jìn)行篩選，經(jīng)過DNA測序并在已知的核酸與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中比對分析，發(fā)現(xiàn)兩個文庫中共有149個unigene差異表達(dá)