MdAFS細(xì)胞質(zhì)和葉綠體定位表達(dá)對(duì)植物萜類代謝物的影響.pdf

1、萜類代謝化合物對(duì)固著生活的植物扮演者重要的作用，它包括初生代謝產(chǎn)物和次生代謝產(chǎn)物。由于萜類代謝種類繁多，功能多樣，對(duì)萜類代謝的研究顯得尤為重要。蘋果α-法尼烯合酶（MdAFS）是α-法尼烯代謝途徑的終端酶，直接決定α-法尼烯的產(chǎn)生。MdAFS不僅具有α-法尼烯合酶特性，還具有異戊二烯轉(zhuǎn)移酶和單萜合酶特性，它能利用FPP合成α/β-法尼烯，利用GPP合成芳樟醇、β-羅勒烯，β-月桂烯；利用GPP和IPP合成α-法尼烯。本研究通過構(gòu)建蘋果α

2、-法尼烯合酶融合表達(dá)載體，將蘋果α-法尼烯合酶基因在擬南芥細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中過表達(dá)，以研究外源導(dǎo)入α-法尼烯合酶對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥萜類代謝的調(diào)控及揮發(fā)物產(chǎn)物釋放的影響。主要結(jié)果如下：
　　（1）分別從杭白菊葉片、擬南芥葉片和青香蕉蘋果果皮中克隆Rubisco小亞基基因啟動(dòng)子（rbcS1）、葉綠體信號(hào)肽（pla）和蘋果α-法尼烯合酶基因（MdAFS）構(gòu)建表達(dá)載體 pBI122-GFP和pBI122-rbcS1-pla-MdAFS-GFP，

3、瞬時(shí)轉(zhuǎn)化本生煙，結(jié)果證明 pla能夠?qū)dAFS蛋白正確定位于葉綠體中，同時(shí)也證明 rbcS1啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)基因的表達(dá)。
　?。?）構(gòu)建MdAFS細(xì)胞質(zhì)和葉綠體真核表達(dá)載體，由農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥，并用PCR和qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)果證實(shí)成功獲得了細(xì)胞質(zhì)和葉綠體定位的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。
　?。?）分析ABA（100μM/L）、SA（500μM/L）、ETH（50mg/L）、MeJA（100μM/L） MV（100

4、μM/L）、高溫（45℃）、強(qiáng)光（1200μmol/m2/s）和低溫（4℃）對(duì)MdAFS轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的誘導(dǎo)，結(jié)果表明MdAFS基因的表達(dá)受到多種因素的誘導(dǎo)。
　?。?）胞質(zhì)定位和葉綠體定位轉(zhuǎn)基因擬南芥，在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期葉綠素和類胡蘿卜素含量均高于野生型，尤其是盛花期的葉綠素a和類胡籮卜素的含量增加的更為顯著。
　?。?）胞質(zhì)定位轉(zhuǎn)基因株系在蓮座期，除AtIPI2和AtDXS表達(dá)上調(diào)外，其他被檢測(cè)的萜類代謝途徑的基因均無明顯

5、差異，在盛花期時(shí)，AtAACT2、AtIPI1、AtHMGR1和AtDXS等多個(gè)基因相對(duì)于野生型均上調(diào)表達(dá)。蓮座期時(shí)，葉綠體定位轉(zhuǎn)基因株系的AtHMGR1和AtDXS表達(dá)上調(diào)；而盛花期，AtIPI1、AtIPI2、AtHMGR2、AtDXR和AtDXS表達(dá)明顯上調(diào)。這些結(jié)果表明過表達(dá)MdAFS影響了擬南芥萜類代謝基因的表達(dá)。
　?。?）分別檢測(cè)轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥葉片和花的揮發(fā)物，葉片中的萜類揮發(fā)物檢測(cè)結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因擬南芥相對(duì)于野

6、生型擬南芥產(chǎn)生了D-檸檬烯和香葉基丙酮兩種新萜類揮發(fā)物；花中的萜類揮發(fā)物檢測(cè)結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因株系比野生型揮發(fā)物明顯增加，在f1 和P3植株中檢測(cè)到α-法尼烯（(E,E)-α-farnesene），在f6和P4植株中檢測(cè)到了法尼醇（farnesol），在P2植株中檢測(cè)到了β-法尼烯（(Z,Z)-β-farnesene），在f4，f6和P4均檢測(cè)到了芳樟醇（linalool）。
　?。?）測(cè)定轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥葉片中游離態(tài)和