細胞代謝物的實時質(zhì)譜分析方法研究.pdf

1、在單細胞層次研究基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝物組學(xué)等已成為人們發(fā)現(xiàn)生命化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)和深入了解其分子機制的主要方向。這主要可能是因為單細胞層次上的分析更有利于人們對生物體內(nèi)微環(huán)境的認識，與常規(guī)的細胞分析方法相比，單細胞層次上的分析方法更注重細胞個體間的異質(zhì)性，可以檢測到在常規(guī)分析方法中由于平均結(jié)果而被掩蓋掉的重要生物信息，而這些信息可能在疾病尤其是癌癥的早期診斷和預(yù)防方面有著非常重要的作用。同時對生物組成的最小單位和功能相對獨立的

2、單細胞內(nèi)物質(zhì)成分進行分析將有助于在細胞水平上闡明生物體尤其人體代謝和遺傳等方面的生理過程。但是由于細胞內(nèi)物質(zhì)的含量極低且種類具有復(fù)雜和多樣性，所以對分析方法所需樣品量、靈敏度及抗干擾能力等方面有較高的要求。目前仍沒有能夠同時完全滿足上述條件的質(zhì)譜分析方法。為了能夠?qū)渭毎麑崿F(xiàn)準(zhǔn)確、原位及直接實時的分析，本論文做了以下一些探索研究:
　　1、細胞是一個極為復(fù)雜的體系，在使用質(zhì)譜分析中會存在嚴重的基質(zhì)效應(yīng)，而且細胞內(nèi)物質(zhì)含量均較低，檢

3、測中如果存在較強的基質(zhì)效應(yīng)，會大大降低分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。為了能夠較好的降低或控制質(zhì)譜在檢測細胞樣品時存在的基質(zhì)效應(yīng)，本文研究離子源產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)的本質(zhì)原因及消除方法，開發(fā)了能夠克服或降低基質(zhì)效應(yīng)的基于超聲波能的離子源。該離子源主要是利用超聲波能量將分析物進行離子化，并且采用多孔材料限制噴霧的初始液滴尺寸，大大降低了液滴的尺寸并且提高了液滴尺寸的均一性，使得該離子源能夠顯著的克服或降低分析復(fù)雜基質(zhì)時所存在的基質(zhì)效應(yīng)，成功的應(yīng)用于血清

4、、尿液及細胞培養(yǎng)液等復(fù)雜體系的研究。另外細胞代謝活動中會產(chǎn)生易揮發(fā)代謝產(chǎn)物，對其產(chǎn)生的氣體代謝物進行檢測能夠很好的反映該細胞所處的生理狀態(tài)。但是細胞的生存環(huán)境多為水-電解質(zhì)溶液，臨近環(huán)境的氣體濕度較大，高濕度環(huán)境對常規(guī)質(zhì)譜檢測通常是一個巨大的挑戰(zhàn)。本文開發(fā)了一種基于質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的大氣壓敞開式離子源，實現(xiàn)了對對不同生長期植物釋放的氣相物質(zhì)的直接實時監(jiān)測。
　　2、細胞是維持生物體活動的最小單元，為了更好地保證生命活動，每個細胞中都含

5、有很多不同類型的化合物，所以要求分析方法要能夠同時實現(xiàn)對多種類型物質(zhì)的同時檢測。為了能夠?qū)崿F(xiàn)對細胞內(nèi)物質(zhì)全面的分析，本文建立了可以同時分析極性和非極性物質(zhì)的方法。本方法采用將能夠產(chǎn)生等離子體的大氣壓化學(xué)離子源與噴霧型離子化的多孔材料輔助的超聲波噴霧離子源進行聯(lián)合，得到了一種等離子體增強型多孔材料輔助的超聲波噴霧離子源。該離子源能夠同時產(chǎn)生等離子體型和噴霧型兩種離子化模式，實現(xiàn)了對極性和非極性物質(zhì)的同時檢測，同時保留了多孔材料輔助的超聲波

6、噴霧離子源抗基質(zhì)干擾的特性。
　　3、細胞時時刻刻都在不停的運轉(zhuǎn)，細胞內(nèi)的物質(zhì)成分和含量也在不斷發(fā)生變化，這就要求分析方法能夠做到對細胞內(nèi)物質(zhì)的實時動態(tài)監(jiān)測。為了能夠較好的實現(xiàn)對細胞內(nèi)物質(zhì)的實時監(jiān)測，本文選用了變化較快的化學(xué)反應(yīng)作為模型，使用等離子體增強多孔材料輔助的超聲波噴霧離子源質(zhì)譜實現(xiàn)了對化學(xué)反應(yīng)過程的在線監(jiān)測。利用等離子體增強多孔材料輔助的超聲波噴霧離子源實現(xiàn)了氮參雜石墨烯催化的對硝基苯酚和硼氫化鈉氧化還原反應(yīng)的在線監(jiān)測。

7、監(jiān)測到了在反應(yīng)過程中反應(yīng)物、中間體以及產(chǎn)物隨時間的變化，并通過氘代實驗證明該反應(yīng)中還原過程的氫來自于水中的氫正離子，推測出了該反應(yīng)的反應(yīng)路徑，成功的驗證了該方法可以用于物質(zhì)組成和濃度均發(fā)生變化的復(fù)雜體系的原位實時監(jiān)測的能力。
　　4、為了能夠準(zhǔn)確的知道取樣的細胞位置，并且能夠同時滿足以上三個條件，搭建了基于感應(yīng)納升電噴霧離子化質(zhì)譜與膜片鉗取樣技術(shù)結(jié)合的工作平臺，實現(xiàn)了直接對哺乳動物單個細胞內(nèi)液中化學(xué)物質(zhì)的分析。首先使用帶有微操裝置

8、的生物顯微鏡平臺將單個細胞內(nèi)液抽入納升電噴霧離子源的噴針中，其次將該噴針放到感應(yīng)納升電噴霧離子源裝置中，然后采用200 Hz，4 kV的感應(yīng)電壓將分析物進行離子化。成功的利用質(zhì)譜分析技術(shù)檢測出了人胚腎細胞和腦片單個神經(jīng)元中一些重要代謝產(chǎn)物。本文還采用四氯化碳構(gòu)建了人胚腎細胞的受損模型，成功的在單細胞層次檢測到不同受損程度的細胞內(nèi)液中代謝物的變化，且發(fā)現(xiàn)其中肌酸酐的變化趨勢與臨床診斷結(jié)果相符。另外本文通過膜片鉗與感應(yīng)納升電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用方式