冬凌草甲素大鼠體內(nèi)代謝物的鑒定與藍萼香茶菜中二萜類質量控制方法研究.pdf

1、冬凌草甲素是從香茶菜屬（Isodon）許多植物中分離出來的一種貝殼杉烷二萜類（ent-kaurene diterpenoid）化合物，藥理學研究發(fā)現(xiàn)，該成分由于具有較強的抗癌和抗腫瘤活性，有望開發(fā)成為一種新型的抗腫瘤和抗癌藥物。冬凌草甲素的藥代動力學和排泄研究結果表明，冬凌草甲素在體內(nèi)發(fā)生明顯的生物轉化。藥物代謝研究是新藥研究的重要組成部分，因此，有必要對冬凌草甲素的代謝進行研究，為進一步的藥理、毒理研究提供必要的前期研究數(shù)據(jù)。本文采用

2、超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技術，鑒定大鼠口服冬凌草甲素后尿液及膽汁中的代謝物，研究了冬凌草甲素在大鼠體內(nèi)的代謝情況，總結了冬凌草甲素在體內(nèi)代謝物的質譜裂解規(guī)律，并推測了可能的代謝途徑。藍萼香茶菜為香茶菜屬植物藍萼香茶菜（ Isodon japonica var. glaucocalyx(Maxim.) Hara）的干燥全草或葉。臨床上主要用于治療咽喉腫痛、扁桃體炎、胃炎、乳腺炎、肝炎和感冒發(fā)

3、熱等癥。藍萼香茶菜在我國分布廣泛，且香茶菜屬許多植物外觀類似，市場上該藥材植物基源混亂，且不同產(chǎn)地、不同采收季節(jié)和不同用藥部位的藍萼香茶菜的化學成分存在明顯差異。因此，控制和鑒定藍萼香茶菜中主要的有效成分對于藥材的質量評價十分重要。本研究建立了液質（HPLC-ESI-MS/MS）聯(lián)用法同時測定了藍萼香茶菜藥材中8種二萜類化學成分的含量，并采用主成分分析法對不同來源不同部位的藍萼香茶菜進行質量分析，為藍萼香茶菜藥材的質量控制提供科學依據(jù)。

4、同時為了更加準確、全面的、科學客觀地了解藍萼香茶菜中含有的微量二萜類化合物，同時采用UPLC-Q-TOF-MS/MS法對藥材中二萜類成分進行了快速鑒別和結構分析，從而為全面深入研究中藥活性成分與中藥藥效的相關性奠定基礎。本研究分為三個部分：
　　第一部分：UPLC-Q-TOF-MS/MS法鑒定冬凌草甲素大鼠體內(nèi)代謝物。
　　目的：采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術鑒定大鼠口服給予冬凌草甲素后尿液和膽汁中代謝物，同時研究

5、冬凌草甲素在大鼠體內(nèi)的代謝物類型，闡明冬凌草甲素體內(nèi)的代謝途徑。
　　方法：大鼠灌胃給予冬凌草甲素后，收集大鼠的尿液和膽汁，經(jīng)液-液萃取進行分離純化前處理。首先采用 UPLC-Q-TOF-MS/MS技術，ESI源，負離子模式，全掃描結合多重質量虧損（MMDF）和動態(tài)背景扣除（DBS）的方法進行數(shù)據(jù)采集，同時觸發(fā)信息依賴采集（IDA），每一循環(huán)采集8個響應最強峰的二級質譜圖來分析樣品，然后采用多種數(shù)據(jù)后處理方法進行代謝物的篩選，包括

6、提取離子（XIC），質量虧損過濾（MDF），子離子過濾（PIF），中性過濾（NLF）等進行數(shù)據(jù)處理，獲得代謝物的精確分子質量、元素組成和二級質譜圖，最后基于精確質量數(shù)、相關的生物代謝轉化規(guī)律和母藥化合物的裂解規(guī)律，對冬凌草甲素可能的代謝產(chǎn)物進行結構推測，對代謝物中存在的同分異構體利用Clog P值輔助進行區(qū)分。色譜柱為菲羅門Kinetex C18柱（100 mm×2.1 mm，2.6μm），柱溫為25 oC，流動相為甲醇和0.1％甲酸水

7、溶液，梯度洗脫，流速為0.4 mL/min，進樣體積為5μL，運行時間為15 min。
　　結果：本研究使用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術共鑒定冬凌草甲素在大鼠體內(nèi)的18個代謝產(chǎn)物（一相代謝物16個，二相代謝物2個），其中尿液中發(fā)現(xiàn)10個代謝物，膽汁中發(fā)現(xiàn)17個代謝物。研究結果顯示，冬凌草甲素的主要代謝途徑是還原反應和氧化反應，其中羥基和碳碳雙鍵是反應的主要位點。二相代謝反應主要是葡萄糖醛酸反應。
　　結論：本研究采用

8、UPLC-Q-TOF-MS/MS技術，首次成功發(fā)現(xiàn)和鑒定了冬凌草甲素大鼠體內(nèi)代謝物，為冬凌草甲素在體內(nèi)過程的闡明和藥理學研究奠定了基礎。該方法快速、靈敏度高、分辨率高，可用于其他單體成分和中藥材進入體內(nèi)的成分分析。
　　第二部分：液質聯(lián)用法同時測定藍萼香茶菜中8種二萜類成分及其主成分分析。
　　目的：建立一種高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質譜法（HPLC-ESI-MS/MS）同時測定藍萼香茶菜中河北冬凌草素K、冬凌草乙素、延命草

9、醇、拉西多寧、henryin、藍萼甲素、冬凌草甲素和牛尾草素A8種二萜類的含量，并用于不同來源藍萼香茶菜的質量分析，同時采用主成分分析法（PCA）找出影響藥材質量的主要因素。
　　方法：采用多反應監(jiān)測（MRM）模式同時監(jiān)測藍萼香茶菜中8種二萜類化學成分。ESI源，負離子監(jiān)測模式，源噴射電壓為-4500 V，離子源溫度為650℃。霧化氣（Gas1）：40 psi，加熱氣（Gas2）：50 psi，簾氣：25 psi。8種被測成分的監(jiān)

10、測離子對分別為：河北冬凌草素K365.2/317.2，冬凌草乙素361.3/343.2，延命草醇365.2/347.2，拉西多寧363.2/197.0， henryin391.2/58.9，藍萼甲素331.0/313.0，冬凌草甲素363.2/345.1和牛尾草素A363.2/255.1。色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5μm），流動相為甲醇-水，梯度洗脫，流速0.8 mL/min，柱溫2

11、5℃。采用該法對31批藍萼香茶菜中8種二萜進行了測定，并采用PCA找出了影響藍萼香茶菜質量的主要化學成分。
　　結果：被測8種二萜類成分的峰面積和濃度在測定濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關系，儀器重復性、日內(nèi)和日間精密度、穩(wěn)定性、檢測限和定量限均符合要求。平均加樣回收率為93.45-103.3%，RSD小于5.6%。測定結果表明，產(chǎn)地、生長環(huán)境、采收時間和用藥部位等因素均對8種活性成分的含量有影響，藍萼甲素和henryin含量最高，被認

12、為是影響其質量的主要活性成分。PCA得分散點圖表明，31批樣品被明顯的聚為兩大類，表明產(chǎn)地對藥材的質量差異會產(chǎn)生一定的影響。
　　結論：該方法操作方便、簡單快速、專屬性強、靈敏度高、結果準確可靠，可用于藍萼香茶菜藥材中多種二萜類成分的同時定量測定。同時， PCA法可為藍萼香茶菜藥材分類和質量評價提供依據(jù)，為節(jié)約藥材資源及合理用藥提供借鑒和參考。
　　第三部分：基于UPLC-Q-TOF-MS/MS和模板過濾技術快速識別和鑒定藍

13、萼香茶菜中二萜類成分。
　　目的：總結二萜類化學成分的電噴霧質譜裂解規(guī)律，采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術，建立快速識別和鑒定藍萼香茶菜中的微量二萜類成分的方法。
　　方法：首先采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術，通過電噴霧離子源負離子模式下一級質譜掃描、母離子掃描和子離子掃描，研究了8個具有代表性的對映-貝殼杉二萜類成分對照品的質譜裂解途徑，并總結其規(guī)律。然后對藍萼香茶菜提取液在負離子模式下進行TOF-MS-

14、IDA-8MS/MS掃描，獲得全掃描質量色譜圖。然后利用自建過濾模板結合多種數(shù)據(jù)后處理技術，篩選和鑒定藍萼香茶菜中二萜類化學成分。色譜柱為 Phenomenex Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，2.6μm）色譜柱，柱前接有在線過濾器，柱溫25℃，流動相為水和甲醇溶液，梯度洗脫，流速0.3 mL/min，進樣量為2μL。
　　結果：通過電噴霧離子源負離子模式一級質譜掃描、母離子掃描和子離子掃描，總結出藍萼香茶菜中

15、8個二萜類成分（4個不同母核亞型）質譜裂解規(guī)律。據(jù)此采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術首次鑒定出不同批次藍萼香茶菜提取物中24個化學成分，其中8個化合物與對照品的保留時間和二級質譜信息比對可確證其化學結構，其余16個化合物通過“Chemspider”和“Master View”中的XIC功能提供的信息進行鑒定，誤差范圍在±3 ppm之內(nèi)。
　　結論：所建的UPLC-Q-TOF-MS/MS結合模板識別過濾技術方法靈敏度高、專屬