冬凌草甲素大鼠體內(nèi)代謝物的鑒定與藍(lán)萼香茶菜中二萜類質(zhì)量控制方法研究.pdf

1、冬凌草甲素是從香茶菜屬（Isodon）許多植物中分離出來的一種貝殼杉烷二萜類（ent-kaurene diterpenoid）化合物，藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，該成分由于具有較強(qiáng)的抗癌和抗腫瘤活性，有望開發(fā)成為一種新型的抗腫瘤和抗癌藥物。冬凌草甲素的藥代動(dòng)力學(xué)和排泄研究結(jié)果表明，冬凌草甲素在體內(nèi)發(fā)生明顯的生物轉(zhuǎn)化。藥物代謝研究是新藥研究的重要組成部分，因此，有必要對(duì)冬凌草甲素的代謝進(jìn)行研究，為進(jìn)一步的藥理、毒理研究提供必要的前期研究數(shù)據(jù)。本文采用

2、超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技術(shù)，鑒定大鼠口服冬凌草甲素后尿液及膽汁中的代謝物，研究了冬凌草甲素在大鼠體內(nèi)的代謝情況，總結(jié)了冬凌草甲素在體內(nèi)代謝物的質(zhì)譜裂解規(guī)律，并推測(cè)了可能的代謝途徑。藍(lán)萼香茶菜為香茶菜屬植物藍(lán)萼香茶菜（ Isodon japonica var. glaucocalyx(Maxim.) Hara）的干燥全草或葉。臨床上主要用于治療咽喉腫痛、扁桃體炎、胃炎、乳腺炎、肝炎和感冒發(fā)

3、熱等癥。藍(lán)萼香茶菜在我國(guó)分布廣泛，且香茶菜屬許多植物外觀類似，市場(chǎng)上該藥材植物基源混亂，且不同產(chǎn)地、不同采收季節(jié)和不同用藥部位的藍(lán)萼香茶菜的化學(xué)成分存在明顯差異。因此，控制和鑒定藍(lán)萼香茶菜中主要的有效成分對(duì)于藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)十分重要。本研究建立了液質(zhì)（HPLC-ESI-MS/MS）聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定了藍(lán)萼香茶菜藥材中8種二萜類化學(xué)成分的含量，并采用主成分分析法對(duì)不同來源不同部位的藍(lán)萼香茶菜進(jìn)行質(zhì)量分析，為藍(lán)萼香茶菜藥材的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

4、同時(shí)為了更加準(zhǔn)確、全面的、科學(xué)客觀地了解藍(lán)萼香茶菜中含有的微量二萜類化合物，同時(shí)采用UPLC-Q-TOF-MS/MS法對(duì)藥材中二萜類成分進(jìn)行了快速鑒別和結(jié)構(gòu)分析，從而為全面深入研究中藥活性成分與中藥藥效的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)。本研究分為三個(gè)部分：
　　第一部分：UPLC-Q-TOF-MS/MS法鑒定冬凌草甲素大鼠體內(nèi)代謝物。
　　目的：采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)鑒定大鼠口服給予冬凌草甲素后尿液和膽汁中代謝物，同時(shí)研究

5、冬凌草甲素在大鼠體內(nèi)的代謝物類型，闡明冬凌草甲素體內(nèi)的代謝途徑。
　　方法：大鼠灌胃給予冬凌草甲素后，收集大鼠的尿液和膽汁，經(jīng)液-液萃取進(jìn)行分離純化前處理。首先采用 UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)，ESI源，負(fù)離子模式，全掃描結(jié)合多重質(zhì)量虧損（MMDF）和動(dòng)態(tài)背景扣除（DBS）的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，同時(shí)觸發(fā)信息依賴采集（IDA），每一循環(huán)采集8個(gè)響應(yīng)最強(qiáng)峰的二級(jí)質(zhì)譜圖來分析樣品，然后采用多種數(shù)據(jù)后處理方法進(jìn)行代謝物的篩選，包括

6、提取離子（XIC），質(zhì)量虧損過濾（MDF），子離子過濾（PIF），中性過濾（NLF）等進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，獲得代謝物的精確分子質(zhì)量、元素組成和二級(jí)質(zhì)譜圖，最后基于精確質(zhì)量數(shù)、相關(guān)的生物代謝轉(zhuǎn)化規(guī)律和母藥化合物的裂解規(guī)律，對(duì)冬凌草甲素可能的代謝產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)推測(cè)，對(duì)代謝物中存在的同分異構(gòu)體利用Clog P值輔助進(jìn)行區(qū)分。色譜柱為菲羅門Kinetex C18柱（100 mm×2.1 mm，2.6μm），柱溫為25 oC，流動(dòng)相為甲醇和0.1％甲酸水

7、溶液，梯度洗脫，流速為0.4 mL/min，進(jìn)樣體積為5μL，運(yùn)行時(shí)間為15 min。
　　結(jié)果：本研究使用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)共鑒定冬凌草甲素在大鼠體內(nèi)的18個(gè)代謝產(chǎn)物（一相代謝物16個(gè)，二相代謝物2個(gè)），其中尿液中發(fā)現(xiàn)10個(gè)代謝物，膽汁中發(fā)現(xiàn)17個(gè)代謝物。研究結(jié)果顯示，冬凌草甲素的主要代謝途徑是還原反應(yīng)和氧化反應(yīng)，其中羥基和碳碳雙鍵是反應(yīng)的主要位點(diǎn)。二相代謝反應(yīng)主要是葡萄糖醛酸反應(yīng)。
　　結(jié)論：本研究采用

8、UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)，首次成功發(fā)現(xiàn)和鑒定了冬凌草甲素大鼠體內(nèi)代謝物，為冬凌草甲素在體內(nèi)過程的闡明和藥理學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。該方法快速、靈敏度高、分辨率高，可用于其他單體成分和中藥材進(jìn)入體內(nèi)的成分分析。
　　第二部分：液質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定藍(lán)萼香茶菜中8種二萜類成分及其主成分分析。
　　目的：建立一種高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜法（HPLC-ESI-MS/MS）同時(shí)測(cè)定藍(lán)萼香茶菜中河北冬凌草素K、冬凌草乙素、延命草

9、醇、拉西多寧、henryin、藍(lán)萼甲素、冬凌草甲素和牛尾草素A8種二萜類的含量，并用于不同來源藍(lán)萼香茶菜的質(zhì)量分析，同時(shí)采用主成分分析法（PCA）找出影響藥材質(zhì)量的主要因素。
　　方法：采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式同時(shí)監(jiān)測(cè)藍(lán)萼香茶菜中8種二萜類化學(xué)成分。ESI源，負(fù)離子監(jiān)測(cè)模式，源噴射電壓為-4500 V，離子源溫度為650℃。霧化氣（Gas1）：40 psi，加熱氣（Gas2）：50 psi，簾氣：25 psi。8種被測(cè)成分的監(jiān)

10、測(cè)離子對(duì)分別為：河北冬凌草素K365.2/317.2，冬凌草乙素361.3/343.2，延命草醇365.2/347.2，拉西多寧363.2/197.0， henryin391.2/58.9，藍(lán)萼甲素331.0/313.0，冬凌草甲素363.2/345.1和牛尾草素A363.2/255.1。色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-水，梯度洗脫，流速0.8 mL/min，柱溫2

11、5℃。采用該法對(duì)31批藍(lán)萼香茶菜中8種二萜進(jìn)行了測(cè)定，并采用PCA找出了影響藍(lán)萼香茶菜質(zhì)量的主要化學(xué)成分。
　　結(jié)果：被測(cè)8種二萜類成分的峰面積和濃度在測(cè)定濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，儀器重復(fù)性、日內(nèi)和日間精密度、穩(wěn)定性、檢測(cè)限和定量限均符合要求。平均加樣回收率為93.45-103.3%，RSD小于5.6%。測(cè)定結(jié)果表明，產(chǎn)地、生長(zhǎng)環(huán)境、采收時(shí)間和用藥部位等因素均對(duì)8種活性成分的含量有影響，藍(lán)萼甲素和henryin含量最高，被認(rèn)

12、為是影響其質(zhì)量的主要活性成分。PCA得分散點(diǎn)圖表明，31批樣品被明顯的聚為兩大類，表明產(chǎn)地對(duì)藥材的質(zhì)量差異會(huì)產(chǎn)生一定的影響。
　　結(jié)論：該方法操作方便、簡(jiǎn)單快速、專屬性強(qiáng)、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于藍(lán)萼香茶菜藥材中多種二萜類成分的同時(shí)定量測(cè)定。同時(shí)， PCA法可為藍(lán)萼香茶菜藥材分類和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)，為節(jié)約藥材資源及合理用藥提供借鑒和參考。
　　第三部分：基于UPLC-Q-TOF-MS/MS和模板過濾技術(shù)快速識(shí)別和鑒定藍(lán)

13、萼香茶菜中二萜類成分。
　　目的：總結(jié)二萜類化學(xué)成分的電噴霧質(zhì)譜裂解規(guī)律，采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)，建立快速識(shí)別和鑒定藍(lán)萼香茶菜中的微量二萜類成分的方法。
　　方法：首先采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)，通過電噴霧離子源負(fù)離子模式下一級(jí)質(zhì)譜掃描、母離子掃描和子離子掃描，研究了8個(gè)具有代表性的對(duì)映-貝殼杉二萜類成分對(duì)照品的質(zhì)譜裂解途徑，并總結(jié)其規(guī)律。然后對(duì)藍(lán)萼香茶菜提取液在負(fù)離子模式下進(jìn)行TOF-MS-

14、IDA-8MS/MS掃描，獲得全掃描質(zhì)量色譜圖。然后利用自建過濾模板結(jié)合多種數(shù)據(jù)后處理技術(shù)，篩選和鑒定藍(lán)萼香茶菜中二萜類化學(xué)成分。色譜柱為 Phenomenex Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，2.6μm）色譜柱，柱前接有在線過濾器，柱溫25℃，流動(dòng)相為水和甲醇溶液，梯度洗脫，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量為2μL。
　　結(jié)果：通過電噴霧離子源負(fù)離子模式一級(jí)質(zhì)譜掃描、母離子掃描和子離子掃描，總結(jié)出藍(lán)萼香茶菜中

15、8個(gè)二萜類成分（4個(gè)不同母核亞型）質(zhì)譜裂解規(guī)律。據(jù)此采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)首次鑒定出不同批次藍(lán)萼香茶菜提取物中24個(gè)化學(xué)成分，其中8個(gè)化合物與對(duì)照品的保留時(shí)間和二級(jí)質(zhì)譜信息比對(duì)可確證其化學(xué)結(jié)構(gòu)，其余16個(gè)化合物通過“Chemspider”和“Master View”中的XIC功能提供的信息進(jìn)行鑒定，誤差范圍在±3 ppm之內(nèi)。
　　結(jié)論：所建的UPLC-Q-TOF-MS/MS結(jié)合模板識(shí)別過濾技術(shù)方法靈敏度高、專屬