布魯氏菌保護性抗原在卡介苗中的表達研究.pdf

1、布魯氏菌病，簡稱布病，是由布魯氏菌引起的以流產和發(fā)熱為特征的一種人畜共患傳染病。人感染后常表現(xiàn)為持續(xù)性感染，造成多器官的損害,臨床表現(xiàn)為持續(xù)數(shù)日乃至數(shù)周發(fā)熱（包括低熱），多汗，肌肉和關節(jié)酸痛，乏力，兼或肝、脾、淋巴結和睪丸腫大等可疑癥狀及體征。近年來，疫情出現(xiàn)回升勢頭?？刂撇剪斒暇〉闹饕侄我琅f是疫苗免疫。目前人常使用的布魯氏菌疫苗是104M。該疫苗對人的布病預防起到積極有效作用，但人接種104M后，有較強的副作用，嚴重影響到布病高危

2、人群對該疫苗使用的積極性。因此，研制一種副作用小、保護力強的新型疫苗勢在必行。
　　本研究以BCG苗為模板擴增出Ag85B的DNA片段，并與pBS-T載體連接，連接產物和pMV261用EcoRI/HindⅢ雙酶切，回收產物用T4DNA聚合酶連接得到pMV261-Ag85B載體，同時以羊種布魯氏菌生物3型05/43株[1]（新疆地區(qū)分離的強毒株）為模板，克隆編碼bp26和omp25的DNA片段，并與pBS-T載體連接得到pBS-T-

3、bp26和pBS-T-omp25，然后分別用EcoRI/HindⅢ、EcoRI/SalⅠ雙酶切pBS-T-bp26、pMV261-Ag85B及pBS-T-omp25、pMV261-Ag85B并回收目的產物，經(jīng)T4DNA聚合酶連接得到pMV261-Ag85B-bp26和pMV261-Ag85B-omp25。
　　取重組穿梭質粒pMV261-Ag85B-bp26和pMV261-Ag85B-omp25轉化到BCG電感受態(tài)細胞，對獲得的重

4、組疫苗株進行PCR鑒定；布魯氏菌bp26重組卡介苗陽性株（rBCG-bp26和rBCG-omp25）液體培養(yǎng)基中搖菌培養(yǎng)，對其菌液進行westernblot檢測。用布魯氏菌M5-90疫苗株、rBCG-bp26和rBCG-omp25和BCG疫苗株分別免疫SPF級BALB/c小鼠，通過流式細胞術檢測小鼠外周血中CD4+和CD8+T細胞的含量，純化BP26和OMP25蛋白為抗原，rBCG-bp26和rBCG-omp25免疫小鼠血清為一抗，利用

5、westernblot重組疫苗免疫動物的血清學檢測，免疫小鼠肝臟和脾臟做組織切片HE染色，觀察組織病理變化。
　　本研究主要獲得如下結果：
　　1.經(jīng)酶切、PCR和DNA測序鑒定:表明所克隆的信號膚Ag85B片段和bp26、omp25片段與文獻報道一致，pMV261-Ag85B-bp26、pMV261-Ag85B-omp25，的序列正確，連接方向正確，閱讀框與預期一致。成功獲得重組疫苗株rBCG-bp26和rBCG-omp2

6、5。
　　2.采用電穿孔技術成功構建rBCG-bp26和rBCG-omp25：以重組菌株為模板，通過PCR擴增得到bp26、omp25的基因片段，westernblot印跡證實rBCG分泌的蛋白能與布魯氏菌的抗體特異性結合，證實rBCG具有免疫原性。
　　3.安全性試驗結果表明，PBS組、BCG組、rBCG-bp26和rBCG-omp25重組卡介苗組在體征和體重方面無顯著差異，說明rBCG-bp26和rBCG-omp25毒副

7、作用小。
　　4.流式細胞術檢測表明，BCG疫苗株、重組卡介苗疫苗株rBCG-bp26和rBCG-omp25免疫小鼠均可誘導機體產生較強的細胞免疫。
　　5.Westernblot分析顯示純化的BP26、OMP25蛋白在與重組疫苗株rBCG-bp26和rBCG-omp25免疫小鼠血清進行反應時，出現(xiàn)了相應的陽性條帶，證明重組疫苗株可誘導機體產生相應抗體。
　　以上結果表明構建的重組疫苗株rBCG-omp25和rBCG-