重組卡介苗rBCG--XB的免疫原性和保護(hù)性.pdf

1、背景與目的:
　　卡介苗（Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin，BCG）是目前唯一被國際公認(rèn)并廣泛使用的結(jié)核病預(yù)防疫苗?，F(xiàn)已明確其可有效預(yù)防兒童重癥結(jié)核病，但對成人結(jié)核病預(yù)防效果差。然而，成人是結(jié)核病發(fā)病的主要人群。因此，在繼承卡介苗有效預(yù)防兒童結(jié)核病的基礎(chǔ)上，發(fā)展重組卡介苗以增強其預(yù)防成人結(jié)核病的能力，具有重要的科學(xué)意義和實踐價值。基于成人結(jié)核病的發(fā)病機制以及卡介苗不能預(yù)防成人

2、結(jié)核病的潛在機制，本研究中，我們構(gòu)建了一種新型的共表達(dá)Ag85B（原發(fā)感染階段結(jié)核分枝桿菌的分泌抗原）和HspX（潛伏感染階段結(jié)核分枝桿菌特征性表達(dá)抗原）抗原的重組卡介苗菌株，即rBCG::XB。免疫C57BL/6小鼠，比較rBCG::XB與rBCG::85B（表達(dá)Ag85B蛋白）、rBCG::X（表達(dá)HspX蛋白）和BCG抗結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tb）感染的保護(hù)效果及其免疫原性，為獲得

3、更為有效的卡介苗用于結(jié)核病的預(yù)防奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.重組卡介苗 rBCG::XB菌株的構(gòu)建：構(gòu)建質(zhì)粒pMXAg85B并將其電轉(zhuǎn)入BCG中國株而獲得重組卡介苗rBCG::XB，然后用逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR（reverse transcription fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）方法檢測重組卡介苗中Ag85B和HspX的mRNA表達(dá)水平。
　　2.評價重組卡介苗rB

4、CG::XB抗M.tb感染保護(hù)性：將rBCG::XB與rBCG::85B、rBCG::X和 BCG分別免疫C57BL/6小鼠（1×106CFU/只），以PBS為陰性對照，BCG為陽性對照。免疫后第12周，用結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)毒株經(jīng)滴鼻方式感染小鼠，感染劑量為1×105CFU/只。分別在感染4、10和20周后（即三個時間點）處死小鼠，對小鼠的肺臟和脾臟進(jìn)行菌落計數(shù)并評估其肺臟病理改變。
　　3.分析重組卡介苗rBCG::XB

5、的免疫原性：C57BL/6小鼠免疫12和32周后收集小鼠血清或脾細(xì)胞。
　　（1）ELISA方法檢測免疫小鼠脾細(xì)胞分泌抗原特異的Th1和Th2型細(xì)胞因子的水平。
　　（2）ELISA方法檢測免疫小鼠血清中抗原Ag85B和HspX特異的IgG及其亞類IgG1、IgG2a的水平。
　?。?）流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合胞內(nèi)細(xì)胞因子染色檢測抗原Ag85B、HspX和PPD刺激后抗原特異的多功能CD4+T細(xì)胞標(biāo)志。
　　（4）流式細(xì)胞

6、術(shù)結(jié)合胞內(nèi)細(xì)胞因子染色檢測脾細(xì)胞抗原特異的免疫記憶
　　（5）CFSE標(biāo)記法分析Ag85B肽特異的CD8+T細(xì)胞的CTL活性
　　結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建過表達(dá)Ag85B和HspX蛋白的重組卡介苗rBCG::XB菌株，并通過RT-PCR證實其高表達(dá)Ag85B和HspX蛋白。
　　2. rBCG::XB給予機體更強而持久的保護(hù)性。
　　3. rBCG::XB誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異的Th1型免疫應(yīng)答。
　　4.

7、 rBCG::XB誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異的單或多功能CD4+T細(xì)胞。
　　5. rBCG::XB誘導(dǎo)產(chǎn)生更高水平的CD4+記憶性T細(xì)胞。
　　6. rBCG::XB誘導(dǎo)產(chǎn)生更強而持久的Ag85B抗原特異的CTL活性和更高水平的CD8+記憶性T細(xì)胞。
　　結(jié)論:
　　1.共表達(dá)Ag85B和HspX多階段抗原的rBCG::XB抗結(jié)核分枝桿菌感染的保護(hù)性強于BCG和僅表達(dá)單個抗原的重組卡介苗。
　　2.rBCG::XB