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文檔簡介
1、炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)致死率極高,是人畜共患烈性傳染病-炭疽病(Anthrax)的病原體。并且炭疽桿菌來源廣泛、易于培養(yǎng),被作為一種A類生物戰(zhàn)劑進行管理,其防生和反恐一直以來都具有重要的軍事意義和社會意義。炭疽的防控手段包括預防和治療,二者分別主要依賴于炭疽疫苗和抗菌素,但是這兩種藥物均需在感染前或感染初期立即使用。而炭疽毒素中和抗體在宿主感染后期,仍然能有效中和體內(nèi)產(chǎn)生的炭疽毒素,同時發(fā)揮補體依賴細胞毒性
2、作用和抗體依賴細胞毒性作用,是目前最有前景的炭疽治療藥物。
自從1975年雜交瘤技術出現(xiàn)后,多年來單抗治療主要依賴于鼠源單抗,但是鼠源性單抗半衰期短、毒副作用明顯,大大制約了其臨床應用。全人源單克隆抗體應用于人體時具有無免疫原性、半衰期長,國外大多數(shù)新開發(fā)項目現(xiàn)已轉向全人源單抗的研發(fā)。目前全人源單抗制備的方法主要是通過人人雜交瘤技術、轉基因鼠技術、抗體庫技術和單細胞PCR技術,其中通過單細胞PCR技術可直接從人單個B細胞中擴增
3、抗體基因,無需細胞融合培養(yǎng)和抗體多輪篩選的過程,能夠在最短7天內(nèi)篩選獲得有效的全人源單抗,而其他幾種抗體制備方法均需要數(shù)周甚至數(shù)月,建立這種快速高通量抗體篩選平臺,將有助于提升我國新發(fā)突發(fā)傳染病的應對能力;并且,單細胞PCR技術完整保留了抗體重鏈輕鏈在人體內(nèi)的天然配對方式,因此可在獲得治療抗體的同時更加直觀、深入地研究人體免疫機制。但是,由于單個細胞內(nèi)基因拷貝數(shù)非常低,單細胞PCR技術的實現(xiàn)非常困難,目前國內(nèi)罕見成功通過該技術獲得單抗的
4、研究團隊。
目前大部分炭疽單抗仍然是鼠源單抗,少數(shù)研究者從大猩猩、轉基因鼠和人體中篩選獲得了炭疽單抗,而我國仍未見全人源的炭疽毒素單抗報道。鑒于炭疽毒素作用機制的復雜性,研發(fā)更多的針對不同中和表位的炭疽全人源單抗,能夠有效避免炭疽毒素被人為突變帶來的生物恐怖威脅,為炭疽的治療提供更多選擇。鑒于此,本文目的在于建立流式分選-單細胞PCR快速高通量的抗體篩選技術平臺,并通過該技術平臺從重組炭疽保護性抗原(protective an
5、tigen,PA)疫苗免疫的志愿者體內(nèi),篩選獲得全人源PA中和抗體,并對單抗的親和力、抗原結合表位、毒素中和機制、單抗聯(lián)合用藥效果等進行深入研究。
首先對一名男性志愿者在第0天和28天兩次免疫了重組PA疫苗,并在第0、28、35天采集志愿者血液樣品。為確保能夠在合適的時間點采集志愿者陽性的血液樣品,從而提高后續(xù)PA抗體篩選的陽性率,本文通過ELISA和TNA的方法,對不同時間點血清中PA結合和中和抗體滴度進行測量。結果表明,免
6、疫第35天血清中PA結合抗體和中和抗體滴度均明顯升高。同時,通過ELISpot的方法,對不同時間點血液中抗體分泌細胞的數(shù)量變化進行檢測。結果顯示分泌抗PA抗體的抗體分泌細胞占總分泌IgG抗體分泌細胞的比例,從免疫后第28天的0.8%上升至免疫后第35天的23.8%,可見分泌抗PA抗體的抗體分泌細胞個數(shù)大幅升高。表明重組PA疫苗在志愿者有效地激發(fā)人體體液免疫反應,在免疫后第35天時體液免疫水平顯著升高,為后續(xù)抗體的分選提供保證。
7、 為了實現(xiàn)單個B細胞的分選和抗體基因的單細胞PCR擴增,我們嘗試了多種細胞分選和單細胞PCR的方法,在經(jīng)歷多次失敗后,最終采用流式細胞分選抗體分泌細胞,以及多重引物組合的單細胞反轉錄-巢式兩步PCR的方法,成功從人單個B細胞中擴增獲得抗體基因。在單細胞PCR條件優(yōu)化的過程中,我們發(fā)現(xiàn)引物設計、酶的種類和模板量對于擴增效率的影響非常大,而退火溫度對于擴增效果影響甚微。
在成功實現(xiàn)研究中抗體分選的關鍵性技術-流式分選單個抗體分泌細
8、胞和單細胞PCR技術后,采集了志愿者免疫后第35天的血液樣品,通過Ficoll-hypaque密度梯度離心法從血液樣品中分離外周血單個核細胞(peripheral bloodmononuclear cell,PBMC),在對一組抗體分泌細胞表面特異的白細胞分化抗原簇(cluster of differentiation,CD)分子進行熒光染色后,通過流式細胞分選儀從PBMC中分選獲得2112個單個抗體分泌細胞克隆。通過本文前期建立的單細
9、胞PCR方法,對2112個單細胞克隆進行抗體基因的PCR擴增。結果顯示,529個單細胞克隆的重鏈和輕鏈同時擴增成功的陽性率,即單細胞PCR的陽性率約25%。在硬件條件滿足的情況下,僅需1~2天即可完成以上單細胞的分選和抗體基因擴增的過程。
如果采用傳統(tǒng)的克隆方法,構建529對抗體基因的表達質粒,非常耗時費力。為了快速、高通量表達抗體基因,我們設計了可直接通過PCR融合啟動子、前導序列、抗體全長基因、多聚A尾(poly(A) t
10、ail)的線性表達框。我們對線性表達框PCR條件進行優(yōu)化,并使用一株對照抗體驗證線性表達框所表達抗體的表達量和功能。結果顯示,經(jīng)線性表達框表達的抗體量可達0.4μg/mL,且良好保持了抗體中和效果,能夠滿足后續(xù)抗體篩選實驗的要求,通過我們設計的線性表達框可在最短3天內(nèi)表達供后續(xù)篩選用的抗體。在確保方法的可行性后,我們按照優(yōu)化的重疊延伸PCR條件,構建了529對抗體重鏈和輕鏈線性表達框,并將配對的基因共轉染至HEK293T細胞中進行表達。
11、繼而,通過ELISA和TNA的方法對529株全人源單抗進行PA結合和中和活性的檢測,并鑒定了單抗的特異結合的PA結構域。結果顯示,我們成功通過建立的抗體篩選平臺技術獲得34株PA結合單抗,其中4株單抗(2A6、4A3、8H6、22F1)具有PA中和活性。中和單抗22F1與PA不結合,而是通過與PA的變構體PA63結合發(fā)揮作用。另外,研究發(fā)現(xiàn)PA結合單抗中有一種能夠加速細胞死亡的毒素增強抗體(Toxinenhancing mAb),占PA
12、結合單抗的比例達55.9%之多。
為了進一步探究PA中和抗體和毒素增強抗體的特性,構建4株PA中和抗體和1株毒素增強抗體8A7的表達質粒,轉染并純化抗體蛋白;并從以下幾個方面對抗體的功能進行研究:1)通過BLI技術測定了5株重點研究的單抗的親和力;2)測定4株中和單抗在體內(nèi)和體外的中和活性,結果顯示4株中和單抗中22F1單抗中和活性最強,其體外保護效果較上市PA單抗報道結果高出近一個數(shù)量級,而單抗2A6僅在體外具有保護活性;3
13、)鑒定中和單抗的中和機制,結果表明8H6單抗對PA呈現(xiàn)抗體濃度依賴的酶切抑制作用,4A3單抗通過促進PA63的降解而抑制PA七聚體形成,4A3這種類似酶活作用的毒素中和機制尚未見報道,提示本研究可能發(fā)現(xiàn)了一株新中和機制的PA中和單抗。毒素增強單抗8A7能促進PA七聚體的形成,提示其毒素增強作用的可能機制;4)分析單抗的聯(lián)合用藥效果,結果表明2A6和4A3、8H6和22F1表現(xiàn)出較弱的協(xié)同作用;2A6和8H6、2A6和22F1表現(xiàn)出無關作
14、用;4A3和8H6、4A3和22F1表現(xiàn)出拮抗作用。而單抗聯(lián)合用藥協(xié)同效果最為顯著的,是毒素增強單抗8A7與僅在體外具有中和活性的單抗2A6,二者聯(lián)合用藥能夠在體內(nèi)發(fā)揮高水平的毒素中和效果。結果提示我們,在人體內(nèi)之所以大量產(chǎn)生毒素增強抗體的可能原因是,這種抗體在血液中能夠輔助其他抗體發(fā)揮良好的機體保護效果。并且,8A7單抗針對的PA結構域3是目前普遍認為的PA非中和位點,根據(jù)本文所得結果推測針對PA結構域3表位的單抗,在人體內(nèi)能夠通過與
15、其他抗體協(xié)同發(fā)揮重要的生物學功能,這種輔助性單抗在抗體篩選過程中容易被遺漏,但是其在“雞尾酒”治療中發(fā)揮的重要作用不容忽視。
綜上所述,本文建立了基于流式分選和單抗PCR技術的快速抗體篩選平臺,能夠為新發(fā)突發(fā)傳染病抗體研究提供技術儲備;篩選制備了多株不同中和機制的全人源PA中和單抗,其中包含新中和機制的單抗和高中和活性的單抗,是非常有前景的炭疽治療藥物;同時,對抗體中和機制、表位、聯(lián)合用藥效果的研究,也為炭疽毒素作用機理研究、
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