全人源炭疽保護性抗原中和抗體的研究.pdf

1、炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)致死率極高，是人畜共患烈性傳染病-炭疽病(Anthrax)的病原體。并且炭疽桿菌來源廣泛、易于培養(yǎng)，被作為一種A類生物戰(zhàn)劑進行管理，其防生和反恐一直以來都具有重要的軍事意義和社會意義。炭疽的防控手段包括預防和治療，二者分別主要依賴于炭疽疫苗和抗菌素，但是這兩種藥物均需在感染前或感染初期立即使用。而炭疽毒素中和抗體在宿主感染后期，仍然能有效中和體內(nèi)產(chǎn)生的炭疽毒素，同時發(fā)揮補體依賴細胞毒性

2、作用和抗體依賴細胞毒性作用，是目前最有前景的炭疽治療藥物。
　　自從1975年雜交瘤技術出現(xiàn)后，多年來單抗治療主要依賴于鼠源單抗，但是鼠源性單抗半衰期短、毒副作用明顯，大大制約了其臨床應用。全人源單克隆抗體應用于人體時具有無免疫原性、半衰期長，國外大多數(shù)新開發(fā)項目現(xiàn)已轉向全人源單抗的研發(fā)。目前全人源單抗制備的方法主要是通過人人雜交瘤技術、轉基因鼠技術、抗體庫技術和單細胞PCR技術，其中通過單細胞PCR技術可直接從人單個B細胞中擴增

3、抗體基因，無需細胞融合培養(yǎng)和抗體多輪篩選的過程，能夠在最短7天內(nèi)篩選獲得有效的全人源單抗，而其他幾種抗體制備方法均需要數(shù)周甚至數(shù)月，建立這種快速高通量抗體篩選平臺，將有助于提升我國新發(fā)突發(fā)傳染病的應對能力;并且，單細胞PCR技術完整保留了抗體重鏈輕鏈在人體內(nèi)的天然配對方式，因此可在獲得治療抗體的同時更加直觀、深入地研究人體免疫機制。但是，由于單個細胞內(nèi)基因拷貝數(shù)非常低，單細胞PCR技術的實現(xiàn)非常困難，目前國內(nèi)罕見成功通過該技術獲得單抗的

4、研究團隊。
　　目前大部分炭疽單抗仍然是鼠源單抗，少數(shù)研究者從大猩猩、轉基因鼠和人體中篩選獲得了炭疽單抗，而我國仍未見全人源的炭疽毒素單抗報道。鑒于炭疽毒素作用機制的復雜性，研發(fā)更多的針對不同中和表位的炭疽全人源單抗，能夠有效避免炭疽毒素被人為突變帶來的生物恐怖威脅，為炭疽的治療提供更多選擇。鑒于此，本文目的在于建立流式分選-單細胞PCR快速高通量的抗體篩選技術平臺，并通過該技術平臺從重組炭疽保護性抗原(protective an

5、tigen，PA)疫苗免疫的志愿者體內(nèi)，篩選獲得全人源PA中和抗體，并對單抗的親和力、抗原結合表位、毒素中和機制、單抗聯(lián)合用藥效果等進行深入研究。
　　首先對一名男性志愿者在第0天和28天兩次免疫了重組PA疫苗，并在第0、28、35天采集志愿者血液樣品。為確保能夠在合適的時間點采集志愿者陽性的血液樣品，從而提高后續(xù)PA抗體篩選的陽性率，本文通過ELISA和TNA的方法，對不同時間點血清中PA結合和中和抗體滴度進行測量。結果表明，免

6、疫第35天血清中PA結合抗體和中和抗體滴度均明顯升高。同時，通過ELISpot的方法，對不同時間點血液中抗體分泌細胞的數(shù)量變化進行檢測。結果顯示分泌抗PA抗體的抗體分泌細胞占總分泌IgG抗體分泌細胞的比例，從免疫后第28天的0.8％上升至免疫后第35天的23.8％，可見分泌抗PA抗體的抗體分泌細胞個數(shù)大幅升高。表明重組PA疫苗在志愿者有效地激發(fā)人體體液免疫反應，在免疫后第35天時體液免疫水平顯著升高，為后續(xù)抗體的分選提供保證。
　

7、　為了實現(xiàn)單個B細胞的分選和抗體基因的單細胞PCR擴增，我們嘗試了多種細胞分選和單細胞PCR的方法，在經(jīng)歷多次失敗后，最終采用流式細胞分選抗體分泌細胞，以及多重引物組合的單細胞反轉錄-巢式兩步PCR的方法，成功從人單個B細胞中擴增獲得抗體基因。在單細胞PCR條件優(yōu)化的過程中，我們發(fā)現(xiàn)引物設計、酶的種類和模板量對于擴增效率的影響非常大，而退火溫度對于擴增效果影響甚微。
　　在成功實現(xiàn)研究中抗體分選的關鍵性技術-流式分選單個抗體分泌細

8、胞和單細胞PCR技術后，采集了志愿者免疫后第35天的血液樣品，通過Ficoll-hypaque密度梯度離心法從血液樣品中分離外周血單個核細胞(peripheral bloodmononuclear cell，PBMC)，在對一組抗體分泌細胞表面特異的白細胞分化抗原簇（cluster of differentiation，CD）分子進行熒光染色后，通過流式細胞分選儀從PBMC中分選獲得2112個單個抗體分泌細胞克隆。通過本文前期建立的單細

9、胞PCR方法，對2112個單細胞克隆進行抗體基因的PCR擴增。結果顯示，529個單細胞克隆的重鏈和輕鏈同時擴增成功的陽性率，即單細胞PCR的陽性率約25％。在硬件條件滿足的情況下，僅需1～2天即可完成以上單細胞的分選和抗體基因擴增的過程。
　　如果采用傳統(tǒng)的克隆方法，構建529對抗體基因的表達質粒，非常耗時費力。為了快速、高通量表達抗體基因，我們設計了可直接通過PCR融合啟動子、前導序列、抗體全長基因、多聚A尾(poly(A) t

10、ail)的線性表達框。我們對線性表達框PCR條件進行優(yōu)化，并使用一株對照抗體驗證線性表達框所表達抗體的表達量和功能。結果顯示，經(jīng)線性表達框表達的抗體量可達0.4μg/mL，且良好保持了抗體中和效果，能夠滿足后續(xù)抗體篩選實驗的要求，通過我們設計的線性表達框可在最短3天內(nèi)表達供后續(xù)篩選用的抗體。在確保方法的可行性后，我們按照優(yōu)化的重疊延伸PCR條件，構建了529對抗體重鏈和輕鏈線性表達框，并將配對的基因共轉染至HEK293T細胞中進行表達。

11、繼而，通過ELISA和TNA的方法對529株全人源單抗進行PA結合和中和活性的檢測，并鑒定了單抗的特異結合的PA結構域。結果顯示，我們成功通過建立的抗體篩選平臺技術獲得34株PA結合單抗，其中4株單抗(2A6、4A3、8H6、22F1)具有PA中和活性。中和單抗22F1與PA不結合，而是通過與PA的變構體PA63結合發(fā)揮作用。另外，研究發(fā)現(xiàn)PA結合單抗中有一種能夠加速細胞死亡的毒素增強抗體(Toxinenhancing mAb)，占PA

12、結合單抗的比例達55.9％之多。
　　為了進一步探究PA中和抗體和毒素增強抗體的特性，構建4株PA中和抗體和1株毒素增強抗體8A7的表達質粒，轉染并純化抗體蛋白;并從以下幾個方面對抗體的功能進行研究:1）通過BLI技術測定了5株重點研究的單抗的親和力;2）測定4株中和單抗在體內(nèi)和體外的中和活性，結果顯示4株中和單抗中22F1單抗中和活性最強，其體外保護效果較上市PA單抗報道結果高出近一個數(shù)量級，而單抗2A6僅在體外具有保護活性;3

13、）鑒定中和單抗的中和機制，結果表明8H6單抗對PA呈現(xiàn)抗體濃度依賴的酶切抑制作用，4A3單抗通過促進PA63的降解而抑制PA七聚體形成，4A3這種類似酶活作用的毒素中和機制尚未見報道，提示本研究可能發(fā)現(xiàn)了一株新中和機制的PA中和單抗。毒素增強單抗8A7能促進PA七聚體的形成，提示其毒素增強作用的可能機制;4）分析單抗的聯(lián)合用藥效果，結果表明2A6和4A3、8H6和22F1表現(xiàn)出較弱的協(xié)同作用;2A6和8H6、2A6和22F1表現(xiàn)出無關作

14、用;4A3和8H6、4A3和22F1表現(xiàn)出拮抗作用。而單抗聯(lián)合用藥協(xié)同效果最為顯著的，是毒素增強單抗8A7與僅在體外具有中和活性的單抗2A6，二者聯(lián)合用藥能夠在體內(nèi)發(fā)揮高水平的毒素中和效果。結果提示我們，在人體內(nèi)之所以大量產(chǎn)生毒素增強抗體的可能原因是，這種抗體在血液中能夠輔助其他抗體發(fā)揮良好的機體保護效果。并且，8A7單抗針對的PA結構域3是目前普遍認為的PA非中和位點，根據(jù)本文所得結果推測針對PA結構域3表位的單抗，在人體內(nèi)能夠通過與

15、其他抗體協(xié)同發(fā)揮重要的生物學功能，這種輔助性單抗在抗體篩選過程中容易被遺漏，但是其在“雞尾酒”治療中發(fā)揮的重要作用不容忽視。
　　綜上所述，本文建立了基于流式分選和單抗PCR技術的快速抗體篩選平臺，能夠為新發(fā)突發(fā)傳染病抗體研究提供技術儲備;篩選制備了多株不同中和機制的全人源PA中和單抗，其中包含新中和機制的單抗和高中和活性的單抗，是非常有前景的炭疽治療藥物;同時，對抗體中和機制、表位、聯(lián)合用藥效果的研究，也為炭疽毒素作用機理研究、