去泛素化酶Ubp5p和植物同源結(jié)構(gòu)域蛋白家族對(duì)隱球菌毒力與形態(tài)的調(diào)控.pdf

1、第一部分
　　格特隱球菌是臨床上主要的致病真菌之一，多侵犯免疫正常人群，通常會(huì)引起肺部感染疾病，而新生隱球菌多侵犯免疫抑制人群，一般會(huì)引起腦膜腦炎。雖然格特隱球菌和新生隱球菌歸屬于不同的菌種，其感染所致隱球菌病致死率都非常高。
　　去泛素化在蛋白質(zhì)修飾中起著至關(guān)重要的作用，去泛素化酶主要負(fù)責(zé)介導(dǎo)泛素的移除和回收，參與調(diào)控細(xì)胞周期、基因表達(dá)等多種細(xì)胞活動(dòng)。在以往的研究中，我們發(fā)現(xiàn)新生隱球菌中去泛素化酶Ubp5的缺失會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)缺

2、陷和高溫耐受、莢膜生長(zhǎng)和黑色素分泌等毒力顯著下降，提示去泛素化酶Ubp5參與了新生隱球菌生長(zhǎng)與毒力的多效性調(diào)控。為了探索Ubp5在格特隱球菌和新生隱球菌中作用的不同，我們以格特隱球菌為背景構(gòu)建了基因UBP5的基因缺陷株，檢測(cè)基因UBP5的缺失對(duì)格特隱球菌生長(zhǎng)、高溫、各種應(yīng)激應(yīng)答反應(yīng)的敏感性和體內(nèi)毒力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示格特隱球菌和新生隱球菌的UBP5基因缺陷株R265ubp5Δ和H99 ubp5Δ表現(xiàn)出了一些相似的表型。首先是兩者在營(yíng)養(yǎng)

3、正常和營(yíng)養(yǎng)缺乏條件下都表現(xiàn)出了嚴(yán)重的生長(zhǎng)缺陷。根據(jù)以往的研究我們知道去泛素化酶CnUBP5的同源蛋白Ubp15參與了S.cerevisiae的細(xì)胞增殖速率的調(diào)控而CnUBP5也相似的調(diào)控了某些與細(xì)胞周期有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。新生隱球菌和格特隱球菌UBP5基因相似的生長(zhǎng)缺陷引導(dǎo)我們推測(cè)去泛素化酶Ubp5可能在格特隱球菌細(xì)胞增殖調(diào)控中發(fā)揮著與新生隱球菌中相似的作用?；蛉毕葜闞265ubp5Δ和H99 ubp5Δ表現(xiàn)出相似的高溫敏感性，提示兩個(gè)菌

4、種高溫耐受調(diào)節(jié)的保守性。以往的研究表明泛素系統(tǒng)在新生隱球菌種參與了抗真菌藥物敏感性的調(diào)控，而新生隱球菌和格特隱球菌展示了對(duì)抗真菌藥物相似的敏感性。[1]在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)與野生株和回復(fù)突變株相比，格特隱球菌中去泛素化酶Ubp5的基因缺陷株對(duì)兩性霉素B，氟康唑，氟胞嘧啶，伊曲康唑，特比萘酚和伏立康唑的敏感性都顯著增強(qiáng)。而回復(fù)突變株能夠回復(fù)表型進(jìn)一步證實(shí)UBP5可能參與了格特隱球菌和新生隱球菌的耐藥機(jī)制調(diào)控。格特隱球菌基因缺陷株R26

5、5ubp5Δ表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞壁應(yīng)激的高度敏感性，這和新生隱球菌的基因缺陷株是一致的。令人意想不到的是，Ubp5對(duì)黑色素合成和莢膜生成的影響是完全不同的。在L-DOPA培養(yǎng)基上30℃條件下孵育5天后基因缺陷株C.gattii ubp5Δ黑色素產(chǎn)生比野生株略有增強(qiáng)。在咖啡酸培養(yǎng)基上我們也觀察到了更為顯著的黑色素分泌差異。去泛素化酶基因UBP5的敲除增強(qiáng)了格特隱球菌中莢膜的合成。這些數(shù)據(jù)證明了去泛素化酶Ubp5在格特隱球菌中莢膜和黑色素合成中重要

6、的調(diào)控作用。
　　我們分別用小鼠吸入模型和Caenorhabditis elegans模型做了體內(nèi)毒力實(shí)驗(yàn)，對(duì)比了基因缺陷株R265ubp5Δ，野生株和回復(fù)突變株毒力的不同。在小鼠吸入模型中，基因缺陷株感染的小鼠能夠存活80天以上，而且肺組織中的真菌負(fù)荷量顯著低于野生株，腦組織或脾臟組織甚至沒有發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞的存活。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)在感染后80天內(nèi)，基因缺陷株感染小鼠肺組織的真菌負(fù)荷量是呈下降的趨勢(shì)，而且到了第56天肺組織中的酵母

7、細(xì)胞已經(jīng)被完全清除了。與之形成鮮明對(duì)比的是，野生株感染小鼠的肺組織真菌負(fù)荷量在感染后8周內(nèi)一直維持在穩(wěn)定的水平。格特隱球菌中的回復(fù)突變株能夠完全恢復(fù)隱球菌的毒力，這與以往研究中報(bào)道的新生隱球菌回復(fù)突變株的不完全恢復(fù)毒力是不同的。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，盡管感染格特隱球菌的患者主要表現(xiàn)為肺部感染，但是格特隱球菌的酵母細(xì)胞是可以通過血腦屏障而且存活的。這與既往的研究是相一致的[2]。另外一方面，基因UBP5的敲除也導(dǎo)致了酵母細(xì)胞在肺組織完全的清除

8、，這可能最終導(dǎo)致了脾臟和腦組織中真菌負(fù)荷量為零。這個(gè)結(jié)果提示，去泛素化酶Ubp5可能在抑制宿主免疫系統(tǒng)或者介導(dǎo)毒力調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。
　　綜上所述，我們的研究證實(shí)了去泛素化酶Ubp5參與多效調(diào)控格特隱球菌的生長(zhǎng)與毒力，同時(shí)我們通過對(duì)比格特隱球菌和新生隱球菌Ubp5基因缺陷株的表型，發(fā)現(xiàn)Ubp5在格特隱球菌和新生隱球菌中調(diào)控多種應(yīng)激應(yīng)答反應(yīng)具有相似性，但是對(duì)莢膜生成和黑色素合成的影響則差異很大，這進(jìn)一步證明了兩者在進(jìn)化上的保守

9、性和差異性，為臨床上更有靶向的研究?jī)烧叩闹虏C(jī)制提供了證據(jù)和思路。
　　第二部分
　　除了上述研究的高溫耐受、莢膜等經(jīng)典毒力，研究證實(shí)真菌的形態(tài)對(duì)真菌在人體內(nèi)生存也至關(guān)重要。最近研究者發(fā)現(xiàn)新生隱球菌在菌絲相毒力顯著下降，這也和大多數(shù)臨床株以酵母相存在是一致的。為此我們又探索了與酵母相-菌絲相互相轉(zhuǎn)換機(jī)制有關(guān)的影響因素。
　　表觀遺傳參與所有真核生物中基因表達(dá)等很多細(xì)胞活動(dòng)，研究證明表觀遺傳對(duì)菌絲生成具有調(diào)控作用[3]。

10、PHD結(jié)構(gòu)域(Plant homeodomain)是一種重要的表觀遺傳控制因子[4]，目前研究主要集中在PHD結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)學(xué)分析，對(duì)其生物學(xué)功能尤其在真菌中鮮有涉及[5]。本研究中我們選擇PHD結(jié)構(gòu)域作為研究表觀遺傳和新生隱球菌酵母相-菌絲相酵母相-菌絲相轉(zhuǎn)換機(jī)制關(guān)系的切入點(diǎn)。
　　我們選擇新生隱球菌血清D型JEC21標(biāo)準(zhǔn)株來進(jìn)行生物信息學(xué)研究，主要是因?yàn)镴EC21注釋比較完善而且是研究有性繁殖和菌絲生長(zhǎng)的常用模式菌株。我們首先檢

11、測(cè)了PHD基因在真菌細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)期的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示其轉(zhuǎn)錄水平比內(nèi)參基因顯著降低，這說明PHD基因在細(xì)胞生長(zhǎng)過程中可能不起作用或者沒有起到關(guān)鍵性的作用，但也不能排除轉(zhuǎn)錄因子普遍表達(dá)水平較低的原因。為了探索PHD基因在有性交配中是否發(fā)揮重要作用，我們檢測(cè)了不同配型α和a異性交配過程中PHD基因在不同時(shí)間點(diǎn)(0h，3h，10h，24h，48h，72h)的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示只有PHD4出現(xiàn)表達(dá)水平顯著上升，據(jù)此我們可以推測(cè)可能PHD4在有性

12、生殖中起到至關(guān)重要的作用，可以作為我們研究的重點(diǎn)。
　　為了系統(tǒng)研究這些Phd蛋白在新生隱球菌菌絲生成的調(diào)控作用，我們構(gòu)建了所有PHD基因的缺陷株，然后通過與野生株對(duì)比來研究他們?cè)隗w外應(yīng)激應(yīng)答反應(yīng)和菌絲生成調(diào)控中的作用。我們選取XL280作為背景株，因?yàn)樗荍EC21的直系后代，基因序列具有高度同源性，是近幾年研究新生隱球菌有性生殖和菌絲生成的模式菌株，綜合考慮有利于我們進(jìn)行生物學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
　　我們檢測(cè)了所有基因缺陷

13、株對(duì)高溫、NO、氧化應(yīng)激、營(yíng)養(yǎng)匱乏等體外應(yīng)激應(yīng)答反應(yīng)，結(jié)果顯示只有phd3Δ和phd15Δ基因缺陷株具有明顯的生長(zhǎng)缺陷。我們又觀察了基因缺陷株對(duì)莢膜生成和黑色素合成的影響，比野生株對(duì)比，均未發(fā)現(xiàn)明顯異常。綜上所述，我們可以得出，大部分PHD基因不參與以上經(jīng)典應(yīng)激應(yīng)答和毒力因素的調(diào)控，因此可以一定程度上排除這些因素對(duì)菌絲生成的影響。
　　本課題成員在以往的研究中發(fā)現(xiàn)znf1Δ和phd13Δ基因缺陷株在有性繁殖中菌絲生成增多，為了探究

14、是否是由于PHD結(jié)構(gòu)域功能的缺失導(dǎo)致了菌絲生成增多，我們對(duì)所有PHD基因缺陷株進(jìn)行異性交配和同性交配實(shí)驗(yàn)，觀察在此過程中菌絲生成情況。結(jié)果顯示，同性交配過程中，phd2Δ，phd11Δ，phd13Δ和znf1Δ基因缺陷株的菌絲生長(zhǎng)顯著增強(qiáng)。說明Phd2，Phd11，Phd13和Znf1對(duì)菌絲生成是負(fù)向調(diào)控的作用，我們推測(cè)Phd2，Phd11，Phd13和Znf1蛋白可能參與了同性交配過程中抑制菌絲生長(zhǎng)的調(diào)控因子表達(dá)的激活。異性交配實(shí)驗(yàn)中

15、，我們利用JEC20a與缺陷株（α）交配來檢測(cè)基因缺陷株對(duì)異性交配過程中菌絲生長(zhǎng)的影響。我們選用JEC20a是因?yàn)樗陨z的能力很弱，因此可以排除自生菌絲對(duì)異性交配實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。令人意想不到的是，phd2Δα×JEC20a異性交配中我們觀察到菌絲生成是減弱的，這與我們?cè)谕越慌渲杏^察到的現(xiàn)象完全相反。而對(duì)phd13Δandznf1Δ基因缺陷株來說，我們觀察到一個(gè)有趣的現(xiàn)象，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，基因缺陷株同性交配中的菌絲生長(zhǎng)比野生株顯

16、著減弱。這個(gè)結(jié)果引起我們的推測(cè)，Phd13和Znf1可能只是在早期階段參與外激素應(yīng)答的抑制。
　　相比之下，在同性交配和異性交配中基因缺陷株phd3Δ，phd15Δ和phd12Δ都表現(xiàn)出菌絲生成的缺陷。對(duì)基因缺陷株phd3Δ和phd15Δ來說，這種菌絲生長(zhǎng)缺陷可能是由其生長(zhǎng)缺陷造成的，因?yàn)樵谑覝叵滤麄兊纳L(zhǎng)情況也較野生株差很多。Phd12則與之不同，更可能會(huì)參與到菌絲生長(zhǎng)調(diào)控過程。
　　綜上所述，我們的研究證實(shí)了植物同源結(jié)構(gòu)