感染蕭氏松莖象綠僵菌菌株篩選及其致病機理研究.pdf

1、蕭氏松莖象是一種危險性的松樹新害蟲，其危害已成為林業(yè)生產(chǎn)的重要問題，而綠僵菌是生物防治的主要病原真菌之一，本論文篩選出了對蕭氏松莖象致病力較強的綠僵菌Ma1291-2和MaWP-01菌株，系統(tǒng)研究了其生物學特性、致病機理及蕭氏松莖象對綠僵菌侵染的體液免疫反應，并開展了林間生物防治試驗，為該害蟲的生物防治奠定理論和應用基礎。 1.應用10株綠僵菌菌株分別對蕭氏松莖象幼蟲進行致病力測定，結(jié)果表明，以濃度為(1.5±0.5)×106孢

2、子·mL-1的孢子懸液噴菌，7d后校正死亡率最高為91.90％，最低為15.28％，僵蟲率最高為91.32％，最低為24.80％，LT50為5.39-10.12 d，單頭蟲體平均產(chǎn)孢量為106-107孢子·頭-1。其中，Ma1291-2、MaWP-01和Ma1775菌株對蕭氏松莖象幼蟲致病力較強，僵蟲率分別為89.56％，91.32％和88.12％，LT50分別為5.49 d，5.72 d和5.53d，且都具有較高的僵蟲蟲體含孢量。通過

3、時間-劑量-死亡率模型參數(shù)估計發(fā)現(xiàn)，綠僵菌Ma1291-2和MaWP-01菌株對蕭氏松莖象幼蟲的致死效應較強的時間分別在第8d和第9d，處理的孢子濃度越高，其死亡高峰期越早。 2.利用12株金龜子綠僵菌菌株分別對蕭氏松莖象成蟲進行致病力測定，并選擇致病力較強的菌株進行林間感染試驗，結(jié)果表明：Ma1291-2菌株對蕭氏松莖象的致病力最強，其次是MaWP-01菌株。以濃度(1.5±0.5)×108孢子·mL-1接菌，30 d后，Ma

4、1291-2菌株處理其校正死亡率、僵蟲率和僵蟲蟲體含孢量分別為70.59％、70.81％和(1.90±0.34)×108孢子·頭-1，致死速度最快，LT50為13.89 d；MaWP-01菌株處理其校正死亡率和僵蟲率分別為70.02％和69.79％，LT50為15.98 d。通過時間-劑量-死亡率模型參數(shù)估計發(fā)現(xiàn)，綠僵菌Ma1291-2菌株對蕭氏松莖象成蟲的致死效應較強的時間在16-18 d，處理的孢子濃度越高，其死亡高峰期越早。兩菌株

5、林間感染試驗，蕭氏松莖象校正死亡率分別為(57.85±1.19)％和(44.35±2.91)％。可見，Ma1291-2和MaWP-01菌株對蕭氏松莖象幼蟲和成蟲均有較強的致病力，有較大的開發(fā)利用價值。 3.5種常用培養(yǎng)基中，Ma1291-2和MaWP-01菌株在PPDA培養(yǎng)基上的生長最快、產(chǎn)孢量最高。以葡萄糖為碳源，蛋白胨或酵母浸膏為氮源兩菌株的產(chǎn)孢量較高：Ma1291-2菌株孢子萌發(fā)最適宜的碳源是葡萄糖，MaWP-01菌株孢子

6、萌發(fā)最適宜的碳源是葡萄糖和可溶性淀粉。兩菌株的孢子萌發(fā)較好的氮源是蛋白胨和牛肉膏。在溫度25℃-28℃范圍內(nèi)，兩菌株產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)率都最好。在相對濕度90％以上，兩菌株的孢子都有較高的萌發(fā)率。光照對兩株菌株的產(chǎn)孢和萌發(fā)都較大的抑制作用。 4.利用掃描電鏡對綠僵菌Ma1291-2菌株侵染蕭氏松莖象成蟲的部位和侵過程進行研究，結(jié)果表明，該蟲主要侵染的主要部位是腹部。接菌后第2d，孢子已開始萌發(fā)，第3d，成功附著的孢子定向生長產(chǎn)生芽管

7、，有的芽管末端膨大，侵染過程中未發(fā)現(xiàn)有附著胞產(chǎn)生；第4-5 d，孢子定向生長的同時產(chǎn)生菌絲；接菌后第8d，剛死亡的蟲體體表出現(xiàn)新的菌絲及分生孢子；接菌后第9-10 d，未保濕培養(yǎng)的致蟲體布滿菌絲，并產(chǎn)生大量分生孢子，為再侵染提供了條件。 5.探討蕭氏松莖象成蟲血淋巴細胞對綠僵菌Ma1291-2菌株侵染的免疫反應，結(jié)果表明：綠僵菌的侵染誘導了其血細胞的濃度和行為的強烈免疫反應。在侵染過程中，蕭氏松莖象的血淋巴細胞出現(xiàn)數(shù)量增多、聚集

8、形成結(jié)節(jié)、包囊和吞食等現(xiàn)象，最后血細胞黑化并受破壞而裂解。接菌后5-8 d，總血細胞濃度發(fā)生先升高后下降的強烈波動變化，第7d達到最高峰，其濃度為(4.71±0.02)×104細胞·uL-1。蕭氏松莖象成蟲的正常血淋巴中，漿血細胞、粒血細胞、珠血細胞、類絳血細胞和原血細胞分別占總血細胞的數(shù)量比例為(34.46±0.16)％、(17.28±0.16)％、(8.54±0.40)％、(5.01±0.32)％和(4.90±0.05)％，但漿血細

9、胞、粒血細胞和珠血細胞濃度都在接菌后6-10 d發(fā)生急速上升后下降的波動變化，而原血細胞濃度在接菌后第6d極顯著下降，類絳血細胞濃度波動變化較小。 6.蕭氏松莖象幼蟲和成蟲血細胞裂解液中酚氧化酶活性都極顯著高于血漿，分別是血漿中的2.04和1.91倍：幼蟲血細胞裂解液中酚氧化酶活性最高，是成蟲的1.52倍。經(jīng)不同致病力菌株的菌絲裂解液激活后，幼蟲和成蟲血淋巴中的酚氧化酶活性都明顯增強，但隨著菌株致病力的增強，其對酚氧化酶原的激活

10、作用減弱。無致病力Ma20菌株的菌絲裂解液激活后，其酚氧化酶活性最強。在侵染過程中，幼蟲和成蟲血淋巴中的酚氧化酶活性分別在接菌后的3-4 d和8-10 d最強。 7.綠僵菌油劑不僅孢子萌發(fā)率較穩(wěn)定，低濕環(huán)境下萌發(fā)率較高，對高溫適應性較強，而且有利于孢子吸附昆蟲體表，增強其對害蟲的致病力。經(jīng)室內(nèi)培養(yǎng)48 h后Ma1291-2和MaWP-01菌株的分生孢子在油劑中(食用調(diào)和油V：柴油V=3：7)的萌發(fā)率達80％以上，應用該兩菌株的油

11、劑進行超低容量噴菌林間感染和防治試驗，結(jié)果表明：感染試驗中，2種油劑處理，蕭氏松莖象死亡率都極顯著高于對照；Ma1291-2和MaWP-01菌株油劑防治后1a，蕭氏松莖象蟲口密度都極顯著低于對照，防治效果分別為(46.71±1.28)％和(37.57±1.26)％，防治后2a，蟲口密度仍然顯著低于對照，防治效果分別為(45.47±1.70)％和(36.69±0.90)％。說明該2株菌株的油劑對蕭氏松莖象有一定的控制效采，且Ma1291-

12、2菌株在該蟲生物防治中更有應用價值。 8.鑒于蕭氏松莖象成蟲有晝夜上下樹補充營養(yǎng)的習性，利用綠僵菌Ma1291-2菌株無紡布菌條進行感染和林間防治試驗，結(jié)果表明：感染試驗中，蕭氏松莖象校正死亡率和僵蟲率分別為64.25％和62.25％，LT50為14.43 d；林間防治試驗中，2個試驗區(qū)效果分別達(53.80±1.74)％和(51.54±1.35)％。林間無紡布菌條上的含孢量15 d前為107-108孢子·cm-2，以后急速下降