犬白細(xì)胞介素-7基因?qū)θ?xì)小病毒DNA疫苗的免疫增強(qiáng)作用.pdf

1、[目的]
　　 細(xì)胞因子具有明顯的免疫佐劑作用,它通過在體內(nèi)緩慢持久的釋放,從而增強(qiáng)疫苗的免疫作用。白介素-7是動物體一種重要的多功能細(xì)胞因子,白介素-7作為白介素家族的一名重要成員它不僅在促進(jìn)B細(xì)胞、T細(xì)胞的形成和發(fā)育中起重要作用,而且在協(xié)同其它細(xì)胞因子提高機(jī)體免疫能力等方面發(fā)揮著重要作用。為了驗(yàn)證白介素-7基因?qū)NA疫苗的免疫增強(qiáng)作用,本試驗(yàn)利用犬細(xì)小病毒VP2 DNA疫苗與重組犬白介素-7DNA疫苗共同免疫小鼠,在小鼠體

2、內(nèi)分析了犬白介素-7(cIL-7)基因的免疫增強(qiáng)作用。
　　 [方法]
　　 首先從犬脾臟中分離出犬脾淋巴細(xì)胞,然后用conA刺激犬脾淋巴細(xì)胞,利用Trizol法提取犬總RNA,并翻轉(zhuǎn)錄成cDNA,RT-PCR擴(kuò)增出cIL-7基因,然后將cIL-7基因插入到真核表達(dá)載體pcDNA3.1A中,分別構(gòu)建成與Myc/His標(biāo)簽融合和非融合的cIL-7真核分泌型表達(dá)載體pcDNA-cIL7/MH和pcDNA-cIL7。將構(gòu)建好的

3、融合標(biāo)簽表達(dá)載體pcDNA-cIL7/MH質(zhì)粒利用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,使其進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá),同時(shí)將pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞作為對照。培養(yǎng)48小時(shí)后,收集培養(yǎng)基利用三氯乙酸沉淀法沉淀蛋白,以Western-blot檢測構(gòu)建的表達(dá)載體能否介導(dǎo)cIL-7基因在真核細(xì)胞中進(jìn)行分泌表達(dá)。然后用本室之前已經(jīng)構(gòu)建好的VP2表達(dá)載體pcDNA-CD5-VP2與非融合標(biāo)簽的pcDNA-cIL7載體共免疫小鼠,并設(shè)pcDNA

4、3.1、pcDNA-CD5-VP2單免疫小鼠和pcDNA-cIL7單免疫小鼠作為對照,免疫小鼠方法采用肌肉注射方法,DNA質(zhì)粒用DNA無內(nèi)毒素試劑盒抽提,將抽提好的DNA質(zhì)粒注入小鼠的后腿肌肉。小鼠共進(jìn)行免疫兩次,第二次免疫在第一次免疫后14 d進(jìn)行。免疫后,分別在兩次免疫前2 d和一免后35 d,從小鼠眼角進(jìn)行活體采血,分離血清。通過ELISA方法檢測抗體水平,并通過淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和ELISA方法分別檢測免疫后35 d小鼠脾臟淋巴細(xì)

5、胞刺激指數(shù)和γ-干擾素的表達(dá)水平。
　　 [結(jié)果]
　　 結(jié)果表明,本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增的cIL-7基因序列與GenBank中犬的序列完全一致。構(gòu)建的表達(dá)載體能夠介導(dǎo)cIL-7基因在HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行分泌表達(dá)。動物免疫試驗(yàn)結(jié)果顯示,cIL-7與VP2共免疫組小鼠血清的抗體滴度和中和抗體效價(jià)分別極顯著和顯著高于VP2單免疫組(P＜0.01和P＜0.05);共免疫組小鼠淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)和γ-干擾素表達(dá)水平也顯著高于VP2單免疫組