攜帶有犬瘟熱與犬細(xì)小病毒抗原的腺相關(guān)病毒載體疫苗的構(gòu)建.pdf

1、犬瘟熱病毒與犬細(xì)小病毒可以引起犬科、鼬科、大熊貓科等動(dòng)物的烈性傳染疾病，引起動(dòng)物的死亡率可高達(dá)80％，給我國(guó)寵物飼養(yǎng)業(yè)、皮毛動(dòng)物飼養(yǎng)業(yè)、野生動(dòng)物保護(hù)領(lǐng)域均帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前國(guó)內(nèi)外主要使用犬瘟熱與犬細(xì)小病毒的弱毒疫苗對(duì)疾病進(jìn)行防控，但該種類疫苗存在一些不足之處，例如生產(chǎn)成本比較高，弱毒疫苗具有毒力返強(qiáng)的隱患，面對(duì)不同的病毒變異株有其局限性等。
　　本研究旨在構(gòu)建一款高效安全低成本的新型疫苗。我們通過(guò)將犬瘟熱與犬細(xì)小病毒的抗原

2、基因插入到腺相關(guān)病毒(Adeno associated virus，AAV)基因組中，制備成可預(yù)防犬瘟熱與犬細(xì)小疾病的腺相關(guān)病毒重組疫苗。
　　本課題首先選擇犬瘟熱病毒的血凝蛋白基因、融合蛋白基因和犬細(xì)小病毒的衣殼蛋白基因作為抗原基因，并分別插入到腺相關(guān)病毒基因組中。再通過(guò)腺相關(guān)病毒三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)獲得攜帶各抗原基因的重組腺相關(guān)病毒(Recombinant adeno-associated virus，rAAV)。經(jīng)病毒滴度檢測(cè)與外

3、源蛋白表達(dá)檢測(cè)后，將攜帶有犬瘟熱與犬細(xì)小病毒抗原基因的rAAV混合，通過(guò)肌肉注射免疫6周齡的Balb/c小鼠，同時(shí)以英特威犬二聯(lián)疫苗作為陽(yáng)性對(duì)照，以rAAV-GFP病毒作為陰性對(duì)照。在首次免疫實(shí)驗(yàn)中，按照英特威犬二聯(lián)疫苗的免疫程序免疫，即對(duì)小鼠進(jìn)行三次免疫，每次免疫間隔14d。免疫程序結(jié)束后每隔14d對(duì)小鼠進(jìn)行采血與中和抗體的檢測(cè)。我們得到了良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，之后為了進(jìn)一步驗(yàn)證rAAV疫苗的高效性，按照與三次免疫實(shí)驗(yàn)相同的免疫途徑與免疫劑

4、量對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行一次免疫實(shí)驗(yàn)，免疫后繼續(xù)監(jiān)測(cè)中和抗體水平。
　　三次免疫結(jié)果顯示rAAV疫苗可以使小鼠產(chǎn)生高水平的中和抗體。在免疫后所有時(shí)間點(diǎn)中rAAV疫苗使小鼠產(chǎn)生的抗犬瘟熱病毒中和抗體效價(jià)均高于陽(yáng)性對(duì)照，最高時(shí)中和抗體效價(jià)大于1∶500，是陽(yáng)性對(duì)照的4倍。但在免疫后的所有時(shí)間點(diǎn)中，rAAV疫苗使小鼠產(chǎn)生的抗犬細(xì)小病毒中和抗體效價(jià)均與陽(yáng)性對(duì)照接近，中和抗體效價(jià)均在1∶100到1∶200之間，一般認(rèn)為當(dāng)中和抗體效價(jià)大于1∶100時(shí)

5、機(jī)體便可以免受強(qiáng)毒的攻擊。一次免疫結(jié)果顯示rAAV疫苗依然可以使小鼠產(chǎn)生高水平的中和抗體。在免疫后第6周rAAV疫苗使小鼠產(chǎn)生的抗犬瘟熱病毒中和抗體效價(jià)超過(guò)1∶100，然而陽(yáng)性對(duì)照產(chǎn)生的抗犬瘟熱病毒中和抗體效價(jià)始終小于1∶100，理論上我們認(rèn)為陽(yáng)性對(duì)照免疫失敗，在免疫后第8周rAAV疫苗與陽(yáng)性對(duì)照使小鼠產(chǎn)生的抗犬細(xì)小病毒中和抗體效價(jià)均超過(guò)1∶100。在此次免疫實(shí)驗(yàn)中顯示，rAAV疫苗僅需要對(duì)動(dòng)物進(jìn)行一次免疫，理論上就可以達(dá)到對(duì)動(dòng)物的有效

6、免疫。
　　本研究的結(jié)果表明:rAAV疫苗可以激發(fā)小鼠的免疫系統(tǒng)并產(chǎn)生高水平的中和抗體;rAAV疫苗僅需對(duì)動(dòng)物進(jìn)行一次免疫在理論上就可以達(dá)到對(duì)動(dòng)物的有效免疫;rAAV疫苗針對(duì)于犬瘟熱病毒和犬細(xì)小病毒產(chǎn)生的免疫效果不平衡，針對(duì)于犬瘟熱病毒的免疫效果強(qiáng)于針對(duì)犬細(xì)小病毒的免疫效果，這種現(xiàn)象可能是由抗原的選擇、rAAV病毒混合的比例與滴度等原因造成的，可在后續(xù)工作中繼續(xù)摸索病毒配比條件以更好的平衡針對(duì)兩種病毒的免疫效果。綜上所述攜帶有犬瘟