泰山松花粉多糖對(duì)禽波氏桿菌DNA疫苗的免疫增強(qiáng)作用.pdf

1、禽波氏桿菌病是一種新型細(xì)菌性傳染病，其病原體為禽波氏桿菌，主要造成雛禽的呼吸道疾病，引起急性死亡?；疾‰u群生長(zhǎng)緩慢，飼料報(bào)酬率低，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前國(guó)內(nèi)外用于預(yù)防該病所用的疫苗主要有禽波氏桿菌溫度敏感株和全細(xì)胞菌素，但疫苗保護(hù)效果一般，僅能適當(dāng)降低病變的嚴(yán)重程度或延緩臨床癥狀的出現(xiàn)，亟待研發(fā)新型疫苗。而DNA疫苗是一種最新的分子水平的生物技術(shù)疫苗，能夠同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生全面的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)，因此在實(shí)踐應(yīng)用中備受

2、人們關(guān)注。此外，本實(shí)驗(yàn)室從2003年開(kāi)始對(duì)泰山松花粉多糖(TPPPS)進(jìn)行了一系列的研究，發(fā)現(xiàn)泰山松花粉多糖作為疫苗佐劑能夠顯著提高滅活疫苗和亞單位疫苗的免疫效果，然而以泰山松花粉多糖作為DNA疫苗佐劑尚未被研究。因此，為研發(fā)新型有效的禽波氏桿菌疫苗，本課題選取禽波氏桿菌外膜蛋白A(OmpA)基因?yàn)槟康幕驑?gòu)建真核重組表達(dá)質(zhì)粒并制備DNA疫苗。為提高DNA疫苗的免疫效果，我們選取泰山松花粉多糖作為疫苗佐劑同時(shí)評(píng)估其對(duì)DNA疫苗的免疫調(diào)節(jié)

3、作用。
　　根據(jù)NCBI發(fā)表的禽波氏桿菌OmpA基因設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離得到的禽波氏桿菌菌株的OmpA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增并連接到pMD18-T質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化并送至測(cè)序公司測(cè)序。用EcoRⅠ與XhoⅠ酶切處理pMD18-T-OmpA質(zhì)粒獲得OmpA基因并將得到的OmpA基因連接到已用EcoRⅠ與XhoⅠ處理的pVAX1質(zhì)粒上，將重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切檢測(cè)與測(cè)序。
　　將驗(yàn)證構(gòu)建正確的重組真核質(zhì)粒pVAX1-OmpA轉(zhuǎn)染BH

4、K-21細(xì)胞，72 h后收獲細(xì)胞上清液獲得表達(dá)的OmpA蛋白。將獲得的OmpA蛋白通過(guò)His標(biāo)簽鎳柱層析法進(jìn)行純化，純化的OmpA蛋白的SDS-PAGE分析顯示目的條帶大小約為27 KD，與預(yù)期結(jié)果相符。同時(shí)，OmpA蛋白的Western blotting鑒定可清晰地看見(jiàn)約27 KD大小的特異性條帶，與其SDS-PAGE分析結(jié)果相一致。
　　依照本實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)的水提醇沉法提取泰山松花粉多糖，并將大量提取的重組質(zhì)粒與泰山松花粉多糖或弗

5、氏不完全佐劑等體積配比制備疫苗。將224只1日齡SPF雛雞隨機(jī)分為7組，于1、7、14日齡時(shí)，每組每只雛雞分別注射等量的3個(gè)不同多糖濃度(50 mg/mL、100 mg/mL、200 mg/mL)的DNA疫苗、弗氏佐劑DNA疫苗、純DNA疫苗、空質(zhì)粒和PBS。在首次免疫后的第7、14、21、28、35、42、49天每組隨機(jī)選取3只雛雞采血檢測(cè)其血清抗體效價(jià)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)含量、白細(xì)胞介素-4(IL-4)含量、干擾素-γ(IF

6、N-γ)含量，外周血CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量水平。同時(shí)，在三次加強(qiáng)免疫后每組隨機(jī)選取20只進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，連續(xù)7天記錄雞群生存狀態(tài)并統(tǒng)計(jì)免疫保護(hù)率。結(jié)果顯示，禽波氏桿菌OmpA DNA疫苗能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體、提高細(xì)胞因子分泌量和外周血CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)，并為雛雞提供50％的免疫保護(hù)。另外，泰山松花粉多糖和弗氏佐劑能夠顯著提高雛雞體液免疫和細(xì)胞免疫水平且200 mg/mL的松花粉多糖效果最優(yōu)(P＜0.05)。