中國沿海三疣梭子蟹群體形態(tài)、生化與分子遺傳多樣性研究.pdf

1、本研究在表型水平上應用多元分析(聚類分析、主成分分析、判別分析)對中國沿海三疣梭子蟹群體的形態(tài)學、脂肪酸與微量元素進行了比較研究,并在群體遺傳水平上應用多種分子標記技術(ITS、D-Loop、AFLP、SSR)對其群體的遺傳多樣性和遺傳分化進行了系統(tǒng)研究,以期為三疣梭子蟹種質資源合理開發(fā)利用提供基礎性數(shù)據(jù)和參考。具體內容如下:
　　(1)運用三種多元分析方法,即聚類分析、主成分分析和判別分析,通過測量三疣梭子蟹23個形態(tài)學性狀參數(shù)

2、,對中國海大連海區(qū)、東營海區(qū)、連云港海區(qū)、舟山海區(qū)和湛江海區(qū)5個種群三疣梭子蟹的形態(tài)差異進行了比較研究。聚類分析結果表明,連云港種群和東營種群形態(tài)最為相似(形態(tài)距離0.07),大連種群與東營種群、大連種群與舟山種群的趨異程度逐漸增加,形態(tài)距離分別為0.08和0.09,而湛江種群的趨異程度最大,與其余4種群的形態(tài)距離達0.15以上。主成分分析構建了3個主成分,其貢獻率:主成分1為27.39％,主成分2為15.23%,主成分3為10.27%

3、,累積貢獻率為52.89%。在第1主成分中,比例性狀ICM/CL、BCW/CL、PWC/CL和SW/CL的影響比較大。判別分析結果表明,5個海區(qū)種群之間的形態(tài)差異極顯著(P<0.01),通過建立5個地理種群的判別函數(shù),結果判別準確率P1為63.64%~94.44%，P2為67.74%~92.86%,綜合判別率為82.24%,因此,該判別方程具有較高的判別效果。
　　(2)為探明分布于中國四大海區(qū)的天然三疣梭子蟹群體脂肪酸組成狀況及

4、群體差異,并建立群體判定的指紋標記以應用于種質鑒定和資源保護。本文應用脂肪酸指紋標記結合多元分析方法在表型水平上研究中國四大海區(qū)中湛江、大連、連云港、東營、舟山和漳州海區(qū)6個天然種群三疣梭子蟹的脂肪酸差異和系統(tǒng)發(fā)生關系,并建立了群體判定的脂肪酸指紋標記。結果表明,四大海區(qū)6種群體三疣梭子蟹脂肪酸存在顯著差異(P<0.01),均含有27種脂肪酸。其中,反式油酸、棕櫚酸、DHA、EPA和芥酸這5種脂肪酸的總含量在6群體中均高達82%以上。油

5、酸、二十碳一烯酸、芥酸、ARA和EPA這5種脂肪酸作為脂肪酸指紋標記可以有效的對中國四大海區(qū)的6群體三疣梭子蟹進行種質鑒定,其綜合判別準確率達88.46%。應用所含的27種脂肪酸進行聚類分析顯示四大海區(qū)6種群三疣梭子蟹系統(tǒng)聚類結果與地理距離不具有顯著相關性,這種脂肪酸組成的群體差異可能與遺傳和棲息地食物組成差異有關。本研究結果對于中國海三疣梭子蟹的種質鑒定和原產地資源保護具有重要的應用價值。
　　(3)運用聚類分析、主成分分析和判

6、別分析,通過CAP6300等離子體測定三疣梭子蟹背甲11種微量元素含量參數(shù),對中國海大連海區(qū)、東營海區(qū)、連云港海區(qū)、漳州海區(qū)4個種群三疣梭子蟹背甲的微量元素差異進行了比較研究。聚類分析結果表明連云港種群(LYG)與東營種群(DY)歐氏距離最小為0.55,最為接近,大連種群(DL)與東營種群(DY)和連云港種群(LYG)群這兩種群的趨異程度逐漸增加,歐氏形態(tài)距離為0.59,而漳州種群(ZZ)與上述四個種群的形態(tài)距離最大,均在1.36以上,

7、特別是漳州種群(ZZ)和連云港(LYG)種群形態(tài)距離達到1.76,趨異程度最大。運用主成分分析產生了3個主成分,它們貢獻率分別為:第1種主成分為33.56%,第二種主成分為23.20%,第三種主成分為16.02%,總貢獻率為72.78%,在第1主成分中,微量元素 Co、Mn占主導作用。根據(jù)判別分析結果得出:4個海區(qū)種群之間背甲的微量元素顯著(P<0.01),通過建立一個可以判別4個地理種群的函數(shù),準確率P1為100%。因此,該判別具有較

8、高的判別效果。
　　(4)利用AFLP標記分析了我國六個地理種群三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)遺傳多樣性和遺傳結構。8對引物組合在85個個體生成894個位點,結果顯示,在這些群體具有很高的多態(tài)性。多態(tài)位點比例(PPB)從57.41%(ZS群體)-76.86%(DL群體),據(jù)PPL、I和h,6種群遺傳多樣性有顯著差異(p<0.05)，ZZ,DY和DL的遺傳變異最大,遺傳多樣性最高。為探討群體間的分化,

9、中國海整個三疣梭子蟹群體FST有適度的遺傳分化,(p<0.01),基因流Nm and GST分別為1.9354和0.2053。6群體除LYG和DL、ZS和ZJ、ZZ和DY的分化不明顯FST<0.05、Nem>5,而其他組合均存在較明顯分化,特別是ZS與其它4群體產生了高度的遺傳分化,FST>0.25、Nem為0.5-0.7,基因流極低。ZJ分別與LYG、DL、DY3群體發(fā)生了中度分化,FST為0.18-0.23,Nem為0.63-0.9

10、3。總之,在6群體ZS和ZJ具有高遺傳變異和高度的遺傳分化,ZS、ZJ和LYG這三個群體面臨相當大的選擇性壓力。
　　(5)以大連(DL)、東營(DY)、連云港(LYG)、舟山(ZS)、湛江(ZJ)和漳州(ZZ)6個三疣梭子蟹地理種群為研究對象,采用線粒體控制區(qū)D-loop全基因序列為分子標記,對中國海三疣梭子蟹野生群體的遺傳多樣性及群體遺傳結構進行了分析。結果發(fā)現(xiàn),在用于分析的1141bp的D-loop全基因序列中共有185個變

11、異位點,129個簡約信息位點。60個個體中共計48個單倍型,基因多樣性和核苷酸多樣性指數(shù)顯示中國沿海三疣梭子蟹群體具有較高的遺傳多樣性,而且三疣梭子蟹在過去沒有出現(xiàn)很強的選擇效應,群體大小穩(wěn)定。6種群三疣梭子蟹遺傳分化指數(shù)(FST)為0.1897(P<0.05),將中國沿海三疣梭子蟹作為一個大群體來講已產生了一定的分化。LYG分別和DY,ZJ、ZZ,以及ZJ和ZZ這4組之間無明顯分化,基因流較大(Nem>5),而其他11個群組間已存在一

12、定程度的分化。遺傳距離與地理距離不存在顯著的相關性,群體發(fā)生與擴散可能有更復雜的原因。
　　(6)利用ITS分子標記技術來探討我國三疣梭子蟹的種質資源,目前應用的比較少。采用分子克隆方法對中國海6種群的三疣梭子蟹進行 ITS1研究,使用DNASTAR、MEGA、Arlequin311等軟件對測序結果進行處理,進而研究不同海區(qū)三疣梭子蟹的遺傳多樣性與遺傳分化。結果顯示:A、T、C、G四種堿基的含量在6種群內的變化不大;在ITS1序列

13、中發(fā)現(xiàn)兩個(TAC)n微衛(wèi)星;6種群的三疣梭子蟹的轉換/顛換比值平均為1.213。根據(jù)遺傳距離,可以得出漳州和湛江群體之間最小為0.00651,而舟山和大連之間的最大為0.01111。在三疣梭子蟹內,湛江和漳州群體分為一小支,與大連、連云港聚為一支,東營和舟山群體則分為另一支。群體FST顯示三疣梭子蟹6種群的遺傳分化處于中度分化水平。
　　(7)采用磁珠富集法成功構建了三疣梭子蟹基因組微衛(wèi)星文庫,采用限制性內切酶MseⅠ對三疣梭子

14、蟹基因組DNA酶切,用MseⅠ接頭連接;用生物素標記的寡核苷酸探針(GA)15進行篩選,磁珠富集含有微衛(wèi)星的DNA單鏈序列;對DNA模板進行PCR擴增,連接pUCm-T載體,轉入用氯化鈣制備的感受態(tài)大腸桿菌中,得到微衛(wèi)星序列文庫;利用藍白斑篩選獲得113個陽性克隆,對其測序,得85個含微衛(wèi)星序列,完美型、非完美型、復合型序列分別占總數(shù)的64.71%、22.35%、12.94%。最終選擇設計出31個理想的微衛(wèi)星引物,用一個人工養(yǎng)殖群體進行

15、了檢驗,18個新的微衛(wèi)星標記被驗證具有多態(tài),等位基因數(shù)2-4,群體平水上的Ho和He分別間于0.1481-0.8621和0.4898-0.7475,2個位點顯著偏離 Hardy–Weinberg equilibrium(P<0.01)。為三疣梭子蟹種質評價與遺傳育種研究奠定了科學基礎。
　　為開發(fā)更多有用的多態(tài)性標記,用(CA)15為探針,對連云港30個野生三疣梭子蟹進行了掃描,結果設計的19對引物共篩選出條帶清晰穩(wěn)定、多態(tài)性高的

16、引物14對,見表2。14個標記中,等位基因數(shù)3-9個,群體水上的Ho和He分別間于0.5417-1和0.6164-0.8404,為三疣梭子蟹種質評價與遺傳育種研究奠定了科學基礎。
　　(8)為探明三疣梭子蟹養(yǎng)殖群體對野生資源的遺傳影響,本文利用20對SSR引物對于來自海州灣三疣梭子蟹野生群體與兩個養(yǎng)殖群體進行群體遺傳結構和遺傳分化的研究。結果表明,野生種群遺傳多樣性明顯高于養(yǎng)殖群體,Ho=0.8509,而兩養(yǎng)殖群體的雜合度低于野生

17、群體,Ho分別為0.4525和0.5283。經單因子方差分析顯示海州灣野生三疣梭子蟹的Ne、Ho、He、PIC均顯著高于兩養(yǎng)殖群體(P<0.05),但兩養(yǎng)殖群體的Ne、Ho、He、PIC均無顯著差異(P<0.05)。以上結果說明海州灣天然三疣梭子蟹群體的遺傳多樣性顯著高于養(yǎng)殖群體。三群體的Fst間于0.1085-0.1448間,處于中度分化狀態(tài),Nm處于1.5-2.0間,野生群體與養(yǎng)殖群體的遺傳分化要較養(yǎng)殖群體內部之間更大,基因流也較養(yǎng)