溫度和魚油含量對金錢魚卵巢發(fā)育及相關基因表達的影響.pdf

1、金錢魚（Scatophagus argus）味道鮮美，肉質(zhì)細嫩，在我國沿海及內(nèi)地經(jīng)濟較發(fā)達城市以及臺、港、澳、韓國、日本、泰國等地有廣闊的市場，目前市場價格達100～200元/公斤。迄今，金錢魚大部分養(yǎng)殖種苗仍然來自野生資源，數(shù)量有限且呈逐年減少之勢，因此對其人工種苗的需求量日益加大。
　　本研究以金錢魚為研究對象，用不同溫度（23℃、26℃、29℃）和魚油梯度（0、2％和6%）分別處理2齡雌性金錢魚6周和8周，采用RT-PCR和

2、RACE法，克隆金錢魚叉頭轉(zhuǎn)錄因子（Foxl2）、腦型芳香化酶基因（Cyp19a1b）cDNA全長以及卵黃蛋白原（Vtg）cDNA片段，并應用實時熒光定量PCR檢測了兩種處理對Foxl2在卵巢、Cyp19a1b在腦垂體以及Vtg在肝臟和卵巢中mRNA表達的影響；同時，分別應用比色法、放射免疫測定法（RIA）以及連續(xù)組織切片技術，檢測了兩種處理對卵巢發(fā)育過程中血清中蛋白磷（SPP）、蛋白鈣(SPC)、性類固醇激素（雌二醇：E2,睪酮：T）

3、以及組織學變化的影響，為解決金錢魚人工繁育問題提供理論依據(jù)。主要結(jié)果如下：
　　1.溫度和魚油含量對金錢魚卵巢組織學變化的影響
　　溫度處理實驗結(jié)束（6周）時，23℃和26℃組金錢魚卵巢中出現(xiàn)Ⅲ時相卵母細胞，而29℃組仍和實驗前一樣，卵巢內(nèi)充滿Ⅱ時相卵母細胞；魚油處理實驗結(jié)束時（8周），6%魚油組金錢魚卵巢中出現(xiàn)Ⅳ時相中后期卵母細胞，2%魚油組卵巢中Ⅲ和Ⅳ時相卵母細胞并存，而對照組卵巢中主要為Ⅲ時相卵母細胞。
　　2.

4、溫度和魚油含量對血清性類固醇激素及生化指標的影響
　　溫度對血清中T水平無顯著影響；3周時，23℃和26℃組血清中E2水平略高于29℃組，但6周時兩者顯著大于29℃組（P<0.05）；實驗期間23℃和26℃組血清中SPP含量顯著高于29℃組（P<0.05），而SPC含量僅23℃組顯著高于29℃組（P<0.05）。實驗期間2%和6%魚油組的E2逐漸升高，且在8周時均顯著高于對照組(P<0.05)，而對照組E2無顯著變化；對照組和魚油

5、投喂組SPP值均逐漸上升，且8周時6%魚油組的SPP值顯著高于對照組和2%魚油組（P<0.05）；各魚油處理組SPC和T水平在實驗中期（4周）達到峰值，此后下降。
　　3.溫度和魚油含量對金錢魚Foxl2基因表達的影響
　　金錢魚Foxl2 cDNA全長2024bp，其開放閱讀框（ORF）包含918bp，編碼305個氨基酸，包括104個氨基酸組成的FH結(jié)構(gòu)域（FH-domain），5'端非編碼區(qū)（5'-UTR）有226bp，

6、3'-UTR（不包括poly（A））有848 bp，推測其蛋白質(zhì)分子量為34.365kDa。序列分析及分子系統(tǒng)進化樹結(jié)果表明，金錢魚Foxl2與其它非哺乳類脊椎動物一樣，缺少14個丙氨酸組成的聚丙氨酸重復區(qū)和甘氨酸-脯氨酸重復區(qū)，其氨基酸序列與網(wǎng)紋石斑魚同源性最高，為98.4%，同源性分析結(jié)果與根據(jù)傳統(tǒng)形態(tài)學和生化特征分類的結(jié)果相一致。
　　實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，隨處理時間的延長，23℃和26℃組金錢魚卵巢中Foxl2 mR

7、NA的表達量均逐漸增加，且26℃組的表達量顯著高于23℃組（P<0.05），而29℃組表達量先略增加再回到實驗前水平；魚油處理實驗顯示，2%和6%魚油組金錢魚卵巢中Foxl2 mRNA的表達量均逐漸增加，但兩組間無顯著差異（P>0.05），對照組金錢魚卵巢中Foxl2 mRNA的表達量無顯著變化。
　　4.溫度和魚油含量對金錢魚腦型芳香化酶Cyp19a1b基因表達的影響
　　金錢魚Cyp19a1b cDNA全長2409bp，

8、其開放閱讀框（ORF）包含1506bp，編碼501個氨基酸，5'端非編碼區(qū)（5'-UTR）有164bp，3'-UTR（不包括 poly（A））有712 bp，推測其蛋白質(zhì)分子量為56.697kDa。序列分析及分子系統(tǒng)進化樹結(jié)果表明：金錢魚Cyp19a1b氨基酸序列與黃錫鯛和舌齒鱸Cyp19a1b同源性較高，分別為86.2%、86.5%，但與魚性腺芳香化酶（Cyp19a1a）同源性低于63.5%，同源性分析結(jié)果與根據(jù)傳統(tǒng)形態(tài)學和生化特征分

9、類的結(jié)果相一致。
　　實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，隨處理時間延長，26℃和29℃組金錢魚腦垂體中 Cyp19a1b mRNA的表達量均逐漸降低，但29℃組顯著低于26℃組（P<0.05），而23℃組在6周時則顯著高于26℃和29℃組（P<0.05），約為26℃組表達量的2倍；2%和6%魚油組金錢魚腦垂體中Cyp19a1b mRNA表達量逐漸降低，但魚油對金錢魚腦垂體中Cyp19a1b mRNA的表達量無顯著影響（P>0.05）。<

10、br>　　5.溫度和魚油含量對金錢魚Vtg基因表達的影響
　　克隆獲得金錢魚Vtg基因保守區(qū)片段1449bp。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，Vtg在金錢魚卵巢中的表達量均顯著低于肝臟中的表達量；23℃和26℃組金錢魚Vtg在肝臟中的表達量隨處理時間延長而增加，而29℃組Vtg表達量不變，23℃和26℃組Vtg表達量無顯著差異（P>0.05），但6周時顯著高于29℃組(P<0.05)；8周時，6%魚油組Vtg在肝臟中的表達量明顯高于對