羅非魚卵巢分化和發(fā)育相關(guān)基因Rspol、β-catenin和TSP-1的克隆、表達(dá)和功能鑒定.pdf

1、近年來大量研究發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物雌性性別決定和分化是在性腺體細(xì)胞Fox12和生殖細(xì)胞Wnt4/Rspoi/β-catenin兩條通路的嚴(yán)格控制之下而完成的，β-catenin是雌雄信號(hào)拮抗過程中的重要蛋白。對(duì)硬骨魚類而言，其性別決定除受遺傳基因控制外，雌激素（在硬骨魚類由Cyp19a1a編碼）在卵巢分化過程中起著決定性誘導(dǎo)作用，是卵巢分化的天然誘導(dǎo)劑。長期以來，Wnt4/Rspo1/β-catenin通路在硬骨魚類是否存在以及其在性別決定和分

2、化過程中的作用、對(duì)Cyp19a1a是否存在調(diào)控、與Fox12和Dmrt1控制的體細(xì)胞雌激素合成的關(guān)系未見報(bào)道。本研究首先從羅非魚克隆了Rspo1和由兩個(gè)不同基因編碼的β-catenin（縮寫β-cat，分別命名為β-cat-1和-2）。序列分析發(fā)現(xiàn)硬骨魚類Rspo1、β-catenin氨基酸序列具有較高的保守性，系統(tǒng)發(fā)生分析表明兩種β-catenin在硬骨魚類是一種普遍現(xiàn)象，可能源于進(jìn)化過程中硬骨魚類特有的基因組復(fù)制。另外，我們采用RT

3、-PCR的方法對(duì)羅非魚Rspo1和β-catenin在各組織中的表達(dá)模式進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)Rspo1呈泛表達(dá)的模式，β-cat-1和-2在腦、垂體、鰓、心臟、腎臟、腸、腎臟和性腺中表達(dá)。就性腺而言，β-cat-1只在卵巢中表達(dá)，Rspo1和β-cat-2在卵巢中的表達(dá)要高于精巢。原位雜交研究發(fā)現(xiàn)羅非魚Rspo1、β-cat-1和-2都表達(dá)于卵巢中3時(shí)相及其以前的卵母細(xì)胞，而不表達(dá)于卵巢體細(xì)胞，Rspo1還表達(dá)于精原細(xì)胞和精母細(xì)胞。在孵化后

4、10天的羅非魚卵巢中就能檢測到β-cat-1和-2的表達(dá)信號(hào)，且伴隨著卵巢發(fā)育二者表達(dá)量逐漸升高，直至3時(shí)相卵母細(xì)胞。通過免疫組化還發(fā)現(xiàn)羅非魚β-catenin在卵巢中的蛋白表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于精巢，從而證明在硬骨魚類存在Rspoi/β-catenin介導(dǎo)的生殖細(xì)胞通路，暗示了其可能在硬骨魚類卵巢分化和發(fā)育中具有重要作用。因此，本研究進(jìn)一步采用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)研究了β-catenin是否影響Cyp19a1a轉(zhuǎn)錄活性以及生殖細(xì)胞Rspoi

5、/β-catenin通路與已知性腺體細(xì)胞Fox12和Dmrt1控制的雌激素合成通路之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在HEK293細(xì)胞中，羅非魚β-cat-1和-2單獨(dú)都不能激活Cyp19a1a的轉(zhuǎn)錄，但二者均可以增強(qiáng)Sf1激活的Cyp19a1a啟動(dòng)子活性；Fox12和β-cat-2協(xié)同增強(qiáng)Sf1激活的Cyp19a1a啟動(dòng)子活性，Dmrt1則能抑制β-cat-2增強(qiáng)和Sf1激活的Cyp19a1a啟動(dòng)子活性。以上結(jié)果表明Wnt/Rspoi/β-cat

6、enin信號(hào)通路可能會(huì)和Fox12、Dmrt1-起通過調(diào)控Cyp19a1a轉(zhuǎn)錄和雌激素合成從而影響硬骨魚類的性別決定和分化。
　　 在硬骨魚類，雌激素不僅對(duì)卵巢分化和發(fā)育有重要作用，而且在后期卵巢功能維持上也必不可少，如硬骨魚類卵巢周期性發(fā)育過程也同樣需要大量雌激素的參與。細(xì)胞外基質(zhì)蛋白凝血酶敏感素-1（Thromobospondin-1，TSP）是脊椎動(dòng)物濾泡發(fā)生和卵巢周期性發(fā)育的重要因子，為了進(jìn)一步研究TSP-1在硬骨魚類性

7、腺發(fā)育和產(chǎn)卵周期中的作用以及與雌激素的關(guān)系，本研究從羅非魚和青鳉卵巢中均克隆了由兩個(gè)不同基因編碼的凝血酶敏感素TSP-1a和-1b，對(duì)脊椎動(dòng)物TSP-1進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析發(fā)現(xiàn)，兩種TSP-1僅存在于硬骨魚類。原位雜交結(jié)果發(fā)現(xiàn)TSP-1b從孵化后5天就開始在羅非魚雌雄性腺體細(xì)胞中表達(dá)，在成體卵巢和精巢中則分別表達(dá)于鞘膜細(xì)胞和輸出小管上皮細(xì)胞，TSP-1a從孵化后120天開始特異性表達(dá)于卵巢的顆粒細(xì)胞，這一結(jié)果暗示了TSP-1a可能參與了羅非

8、魚的卵黃發(fā)生，TSP-1b參與羅非魚早期的性腺分化。在羅非魚14天/產(chǎn)卵周期中，TSP-1a和-1b都在產(chǎn)卵后5天（卵黃發(fā)生期）和12天（卵子成熟期）出現(xiàn)兩個(gè)峰值，這種表達(dá)變化規(guī)律與對(duì)羅非魚產(chǎn)卵周期中激素水平如雌激素以及FSH和LH的變化研究一致，表明了它們可能通過影響卵巢體細(xì)胞中激素的合成而參與了羅非魚卵巢周期性發(fā)育。
　　 此外，硬骨魚類卵巢分化和發(fā)育離不開卵巢局部（包括體細(xì)胞和生殖細(xì)胞）因子的參與，它們連接成網(wǎng)，相互影響，

9、通過自分泌或旁分泌的方式產(chǎn)生的雌激素。為了研究性腺局部因子在南方鲇卵巢分化和發(fā)育中的作用，我們還從南方鲇卵巢中克隆了促性腺激素GtHα、FSHβ和LHβ三個(gè)亞基的cDNA序列作為本研究的一個(gè)組成部分（附錄部分）。這三個(gè)亞基除在垂體表達(dá)之外還在卵巢中特異性表達(dá)。在卵巢中，GtHα、FSHβ在孵化后25天就開始表達(dá)，LHβ在孵化后40天開始表達(dá)，與南方鲇原始生殖細(xì)胞有絲分裂和卵原細(xì)胞快速增殖的起始時(shí)間基本一致，說明性腺局部FSH和LH可能參

10、與了南方鲇原始細(xì)胞增殖和早期卵巢發(fā)育。當(dāng)用雌激素受體拮抗劑Tamoxifen對(duì)孵化后5天的南方鲇全雌幼魚進(jìn)行一定時(shí)間的處理后，發(fā)現(xiàn)三個(gè)亞基的表達(dá)水平出現(xiàn)了不同程度的下調(diào)，并出現(xiàn)了部分性逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象。因而，我們推測南方鲇卵巢局部產(chǎn)生的促性腺激素很可能通過“腦-垂體-性腺”軸和其他性腺局部因子一起直接或間接影響雌激素合成從而影響南方鲇早期卵巢分化和發(fā)育。
　　 綜上所述，本研究克隆了羅非魚Rspoi/β-catenin信號(hào)通路重要分子

11、Rspo1、β-catenin和細(xì)胞外基質(zhì)主要成分TSP-1以及南方鲇促性腺激素三個(gè)亞基，研究了它們的組織和細(xì)胞表達(dá)模式，并通過熒光素酶報(bào)告基因首次研究了羅非魚β-catenin對(duì)Cyp19a1a啟動(dòng)子活性的影響。本研究不僅初步闡明Rspoi/β-catenin所介導(dǎo)的生殖細(xì)胞信號(hào)通路在硬骨魚類卵巢分化和發(fā)育中作用，也將其與已知的Fox12和Dmrt1體細(xì)胞控制的雌激素合成調(diào)控途徑相偶聯(lián)，進(jìn)一步豐富了硬骨魚類雌激素合成理論，并提出了以雌