茶樹花蕾發(fā)育相關(guān)基因的分離及表達(dá)研究.pdf

1、茶樹是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，在國民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。茶樹是葉用作物，鮮葉的產(chǎn)量與經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量密切相關(guān)。茶樹從花芽形成到種子成熟，共經(jīng)過約一年半左右的時(shí)間，從6月到12月的6個(gè)月時(shí)間中，一方面是當(dāng)年的茶花進(jìn)行孕蕾、開花和授粉，另一方面是上一年受精的茶花發(fā)育形成種子并成熟的過程，兩年的花果同時(shí)發(fā)育生長，都是大量消耗養(yǎng)分的生理和生長活動(dòng)過程。花果的生長和發(fā)育對(duì)茶樹養(yǎng)分的供應(yīng)要求較高，生殖生長往往會(huì)抑制營養(yǎng)生長，使新梢的生長勢和育芽能力減弱，導(dǎo)

2、致茶樹鮮葉產(chǎn)量減少和品質(zhì)降低。如何控制茶樹的生殖生長，促進(jìn)營養(yǎng)生長是關(guān)系到茶樹產(chǎn)量和品質(zhì)提高的關(guān)鍵性問題。 在茶葉生產(chǎn)上，茶樹的繁殖多采用短穗扦插的無性生殖方式進(jìn)行，有利于優(yōu)良性狀的穩(wěn)定遺傳。茶葉生產(chǎn)上不提倡用種子繁殖，主要是有性繁殖的后代出現(xiàn)性狀分離現(xiàn)象，因而不能像其它作物那樣利用基因型相同的雜種一代。但無性繁殖整個(gè)過程在技術(shù)、設(shè)備和材料方面要求較高，同時(shí)苗木的運(yùn)輸需特殊護(hù)理，與有性生殖比較其花工多、病蟲害容易傳播、抗逆性等也

3、比實(shí)生苗弱，而這些方面種子繁殖具有很大的優(yōu)勢。茶樹雖然是異花授粉植物，但自花結(jié)實(shí)率一般為2％左右，要想利用雜種第一代，需要采取隔離等措施。利用雄性不育育種可以節(jié)約大量母本去雄的勞力，保證種子純度，充分發(fā)揮雜種優(yōu)勢，同時(shí)可以解決育種中存在的茶樹品種趨向單一化和遺傳育種資源不足的問題。 目前，從分子水平上探索與茶樹品質(zhì)有關(guān)的特征性代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)展較快，一些與茶樹品質(zhì)相關(guān)的功能性基因相繼得以克隆和研究，但是對(duì)茶樹生殖發(fā)育相關(guān)的分子生

4、物學(xué)研究甚少。因此，茶樹育性相關(guān)基因的表達(dá)研究，對(duì)闡明茶樹結(jié)實(shí)力的分子機(jī)理有重要的理論意義，為將來利用生物技術(shù)控制茶樹品種的育性，在茶葉生產(chǎn)上利用雜種優(yōu)勢，提高茶葉的產(chǎn)量、品質(zhì)和茶樹的抗性奠定理論基礎(chǔ)。為此本研究分別以茶樹結(jié)實(shí)率差異明顯的品種龍井43、烏龍的發(fā)育早期和發(fā)育晚期的花蕾為材料，重點(diǎn)進(jìn)行如下研究：一是關(guān)于花蕾早期和晚期發(fā)育基因存在的差異表達(dá)方面，利用cDNA-AFLP技術(shù)對(duì)早期和晚期花蕾的差異表達(dá)進(jìn)行分析，二是對(duì)茶樹花蕾的獲得

5、的TDF片段進(jìn)行分析，尋找到與育性相關(guān)的基因進(jìn)行全長克隆和分析。主要結(jié)果如下： 1．對(duì)cDNA-AFLP技術(shù)體系進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明：cDNA-AFLP預(yù)擴(kuò)增比較適宜的退火溫度為53℃，擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)為20個(gè)循環(huán)，預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增PCR體系中Mg<'2+>濃度為2.3mM． 2．利用cDNA-AFLP技術(shù)，對(duì)茶樹花蕾發(fā)育期的基因表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，茶樹花蕾在早期和晚期發(fā)育中的基因表達(dá)有明顯差異。共顯示1110條帶，安

6、徽農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文茶樹花蕾發(fā)育相關(guān)基因的分離及功能分析(2007)其中，晚期發(fā)育的花蕾顯示的特異條帶有87條；選取15個(gè)重復(fù)性好的并在兩個(gè)品種晚期發(fā)育的茶樹花蕾中均特異表達(dá)的片段在GenBank進(jìn)行序列分析，結(jié)果顯示，有9個(gè)分別與氧化還原酶、染色體13、14-3-3蛋白、Amyrel基因、鈣網(wǎng)蛋白、ATP 硫化酶、接觸反應(yīng)/鐵離子結(jié)合蛋白、花粉特異蛋白和干燥相關(guān)蛋白的序列有相似性；2個(gè)與假擬蛋白相似，4個(gè)在GenBank數(shù)據(jù)庫中未找

7、到相似序列。 3．以E12和 M22引物對(duì)茶樹兩個(gè)品種花蕾不同時(shí)期的表達(dá)差異進(jìn)行分析，在兩個(gè)品種的花蕾發(fā)育晚期同時(shí)發(fā)現(xiàn)一條特異表達(dá)條帶 TDF39。RT-PCR證明該基因只在茶樹兩個(gè)品種的晚期發(fā)育花蕾中特異表達(dá)。利用RACE技術(shù)獲得該基因cDNA全長為1072bp，經(jīng)BLAST查找比對(duì)，該基因的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列與楊樹的14-3-3蛋白基因有88％和86％的相似性，同時(shí)，該基因與其它植物的14-3-3蛋白基因在核苷酸序

8、列和推導(dǎo)的氨基酸序列方面均有著比較高的相似性。由此，推斷該基因?yàn)榫幋a茶樹14-3-3蛋白的基因，其ORF由783個(gè)核苷酸組成，編碼260個(gè)氨基酸，5’非翻譯區(qū)和3’非翻譯區(qū)分別為67和222個(gè)核苷酸組成。將茶樹14-3-3蛋白的cDNA克隆到原核表達(dá)載體PET-32a，中，并在表達(dá)宿主菌E. oil BL21trxB(DE3)中高效表達(dá)。結(jié)果表明，表達(dá)的融合蛋白分子量約49．4kDa，該融合蛋白包括112個(gè)氨基酸殘基的硫氧還原蛋白及26

9、0個(gè)氨基酸殘基的14-3-3蛋白。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，表達(dá)的融合蛋白產(chǎn)量逐漸增加，表達(dá)蛋白總量在誘導(dǎo)3h最高達(dá)到菌體總蛋白的34.6％，隨后，菌體總蛋白隨時(shí)間的延長表達(dá)量呈下降趨勢。采用制備SDS-PAGE，提純了在原核表達(dá)的14-3-3蛋白，以此為抗原對(duì)實(shí)驗(yàn)白鼠進(jìn)行免疫注射。經(jīng)Western-blotting檢測獲得的免疫血清產(chǎn)生了特異性抗體，并用Western-blotting的方法驗(yàn)證了茶樹中的14-3-3蛋白只特異性地在茶樹花蕾

10、發(fā)育的晚期表達(dá)，而在茶樹花蕾的發(fā)育早期及根、莖、葉中均不表達(dá)。離體培養(yǎng)時(shí)，研究了14-3-3蛋白對(duì)茶樹的花粉萌發(fā)和花粉管伸長的作用。結(jié)果表明，14-3-3蛋白和一定濃度的殼梭孢菌素對(duì)茶樹花粉的萌發(fā)和花粉管的伸長均有促進(jìn)作用。 4．以E12和M20為引物對(duì)在茶樹花蕾發(fā)育晚期篩選出一條281bp特異表達(dá)的差異條帶 TDF53。RT-PCR分析表明該片段只在花蕾發(fā)育晚期中特異表達(dá)。用RACE方法延伸其末端序列，克隆并測序獲得全長cDN

11、A序列，被GenBank接受，登錄號(hào)為DQ887753。該基因全長2079bp，開放閱讀框1701bp，編碼567個(gè)氨基酸，其分子量為63kDa。序列和結(jié)構(gòu)的同源性分析表明：該基因編碼的氨基酸序列與安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文茶樹花蕾發(fā)育相關(guān)基因的分離及功能分析(2007)煙草、油菜的花粉特異蛋白(pollen specific protein)等同源性較高，由此推定，該基因?yàn)榫幋a茶樹花粉特異蛋白的基因，并將分離到的花粉特異蛋白基因命名為C

12、sPSP。 5．以E12和M24為引物對(duì)在茶樹花蕾發(fā)育晚期篩選出一條310bp特異表達(dá)的差異條帶TDF45。RT-PCR分析表明：該片段只在晚期發(fā)育花蕾中特異表達(dá)。用RACE方法延伸其末端序列，克隆并測序獲得全長cDNA序列，被GenBank接受，登錄號(hào)為DQ444464。該基因全長1736bp，開放閱讀框1404bp，編碼467個(gè)氨基酸，其分子量為52.2kDa。序列和結(jié)構(gòu)的同源性分析表明：該基因編碼的氨基酸序列與土豆、擬南芥