SH系蘋(píng)果砧木AFLP指紋圖譜建立與分析.pdf

1、SH系蘋(píng)果砧木是國(guó)光(Malus domestica var．Rail)和河南海棠(Malus Honanensis Rehder)雜交后代，在抗逆性(抗旱、抗抽條)、矮性、豐產(chǎn)性、果實(shí)品質(zhì)、風(fēng)味、著色等諸多性狀方面有優(yōu)良表現(xiàn)，為適應(yīng)中國(guó)自然條件的蘋(píng)果矮化砧木。以往報(bào)道中，對(duì)SH系砧木主要側(cè)重于從形態(tài)、解剖和生理上研究其矮化效果和生產(chǎn)性能，而在DNA分子水平上有關(guān)SH系不同類(lèi)型間特性研究，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。AFLP(擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性)

2、是一種新的DNA分子標(biāo)記技術(shù)，具有較高的多態(tài)性、較好的穩(wěn)定性和較好的個(gè)體差異，近年來(lái)AFLP技術(shù)越來(lái)越多的用于果樹(shù)資源的研究。本試驗(yàn)選取7種蘋(píng)果SH系砧木及其父、母本，利用AFLP分子標(biāo)記建立了其DNA指紋圖譜，并進(jìn)行了聚類(lèi)分析，為蘋(píng)果優(yōu)良砧木資源的進(jìn)一步收集、利用和保存提供科學(xué)依據(jù)。 主要研究結(jié)果如下： 1．適于AFLP分析的SH系砧木葉片基因組DNA提取方法為改良CTAB法，在2％CTAB提取液中加入1％β-巰基乙醇

3、、2％PVP40及2％Na2S205，3M醋酸鈉和冰凍無(wú)水乙醇同時(shí)沉淀DNA，氯仿/異戊醇(24：1，v/v)抽提，可得到適于AFLP反應(yīng)的純度較高，質(zhì)量較好的DNA。 2．建立了適合蘋(píng)果葉片分析的AFLP銀染技術(shù)體系：在20μL酶切體系中，包括純化后的基因組DNA450ng，EcoRI 3.0U，Mse13.OU，NEB Buffer2 2.0μL，BSA(10mg/mL)0.2μL，37℃酶切5h；加入接頭后，37℃連接10

4、h(或過(guò)夜)；連接產(chǎn)物稀釋10倍進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增；預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物稀釋10倍進(jìn)行選擇性擴(kuò)增；加入10μL Loading Buffer變性后，選擴(kuò)產(chǎn)物在6％變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳和銀染程序。 3．從130對(duì)引物組合中選出20對(duì)譜帶較清晰、多態(tài)性較高的引物組合，對(duì)9份供試樣品進(jìn)行擴(kuò)增分析，共擴(kuò)增出548條電泳譜帶，其中261條為多態(tài)性帶，多態(tài)性比率為47％，根據(jù)材料間的特征帶和差異帶，從而獲得國(guó)光和河南海棠及其雜交后代SH系基因組DNA指

5、紋圖譜。 4．依據(jù)簡(jiǎn)單匹配系數(shù)對(duì)AFLP擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行UPGMA聚類(lèi)，獲得聚類(lèi)樹(shù)狀圖。結(jié)果表明，砧木間相似系數(shù)介于0.47～0.76，在相似系數(shù)0.58的水平上將7種砧木分為2個(gè)類(lèi)群，4個(gè)小組，雜交種SH系砧木存在一定的遺傳多樣性。 5．在相似系數(shù)0.55的水平上，SH系砧木與父本河南海棠，母本國(guó)光分為3個(gè)大的類(lèi)群。SH系砧木自成一個(gè)聚類(lèi)群，聚類(lèi)圖上SH系砧木位置靠近父本，田問(wèn)觀察SH系多數(shù)葉片有較深的缺刻，葉片易出現(xiàn)黃化