溶藻弧菌菌影制備方法改良及菌影對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫保護(hù)機(jī)理的研究.pdf

1、隨著凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖密度的提高和抗生素的濫用，依賴傳統(tǒng)的治療手段治療由溶藻弧菌引發(fā)的疾病越來(lái)越難，急需新型的治療手段。本論文利用分離的溶藻弧菌及其噬菌體，制備溶藻弧菌菌影；利用福爾馬林制備溶藻弧菌滅活疫苗；通過(guò)酚水法提取溶藻弧菌的脂多糖。將這三種制劑通過(guò)注射或投喂的方法免疫凡納濱對(duì)蝦，觀察其對(duì)凡納濱對(duì)蝦抗病力的影響。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)論如下：
　　1.從湛江市水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)下水道水體中分離了一株弧菌，經(jīng)生化鑒定和toxR基因高變區(qū)PC

2、R分子鑒定，確認(rèn)該菌為溶藻弧菌。
　　2.以分離的溶藻弧菌為宿主菌，從湛江水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)下水道污水中分離到一株溶藻弧菌噬菌體。該株噬菌體形成的噬菌斑直徑為1-1.5mm(12h)，對(duì)紫外線敏感，暴露在紫外燈(20W，30cm)下30min可喪失全部裂解活性；在pH8-11范圍內(nèi)裂解活性較強(qiáng)，最適pH值為11；裂解周期為65min；對(duì)65℃以上的高溫敏感；對(duì)乙醚和氯仿有較好的耐受性；對(duì)抗病毒藥物阿昔洛韋敏感；其最大常規(guī)稀釋度為106

3、PFU/mL；最佳感染復(fù)數(shù)為10。
　　3.向培養(yǎng)12h的菌液中加入福爾馬林，使其終濃度分別為0.1％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％，將混合液分別靜置于4℃、25℃、35℃環(huán)境下以及25℃時(shí)放置于回旋振蕩器中搖瓶滅活，再涂平板檢測(cè)滅活效果。篩選出比較理想的滅活條件為：在25℃時(shí)使用濃度為0.1％的福爾馬林搖瓶滅活12h。用酚水法提取溶藻弧菌脂多糖，產(chǎn)率為0.7529％，得到的脂多糖樣品蛋白含量為22.1μg/mg，多糖含

4、量為190.7μg/mg。向體重為7-9g的凡納濱對(duì)蝦分別注射濃度為5mg/mL，4mg/mL，3mg/mL，2mg/mL，1mg/mL，0.5mg/mL，的LPS溶液，每尾注射量為0.1mL，當(dāng)該LPS濃度超過(guò)3mg/mL時(shí)就具有致死作用。
　　4.溶藻弧菌噬菌體菌影的制作方法：將培養(yǎng)12h的溶藻弧菌用無(wú)菌海水洗滌，將其和噬菌體濃縮液按感染復(fù)數(shù)MOI=10的比例加入到無(wú)菌海水中反應(yīng)6h。利用細(xì)菌數(shù)量與其破碎時(shí)釋放于上清液中的核酸

5、含量成線性關(guān)系的原理，得到直線方程y=8E+06x-4E+06，在核酸濃度為2.5-9.7μg/mL的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，可以將其作為計(jì)算菌影濃度的一種方法。以1:1的比例向菌影懸液中加入大蒜提取液反應(yīng)3.5h，可除去殘余活菌，用PBS多次洗滌，即可得到溶藻弧菌噬菌體菌影。
　　5.以注射菌影、滅活疫苗、LPS以及投喂菌影的方式免疫凡納濱對(duì)蝦。在不同的受免時(shí)間攻毒。結(jié)果顯示：將菌影以1×107cells/mL的濃度注射免疫凡納濱

6、對(duì)蝦，在受免后的24h內(nèi)免疫保護(hù)率較強(qiáng)，在受免后的12h時(shí)免疫保護(hù)率最強(qiáng)，達(dá)到53.56％：3者差異不顯著(P>0.05)；將疫苗以1×107cells/mL的濃度注射免疫凡納濱對(duì)蝦，在受免后48h，免疫保護(hù)率最大為57.14％；將LPS以0.5mg/mL的濃度注射免疫凡納濱對(duì)蝦，在受免24h時(shí)達(dá)到最大免疫保護(hù)率為57.14％。
　　投喂菌影免疫凡納濱對(duì)蝦后，免疫保護(hù)率可隨受免時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，YT2在免疫48h后，免疫保護(hù)率達(dá)到