微囊藻毒素對(duì)凡納濱對(duì)蝦細(xì)胞免疫相關(guān)基因表達(dá)水平的影響.pdf

1、微囊藻毒素（Microcystin, MCs）是藍(lán)藻水華最常見(jiàn)的一種藻毒素，常在高溫季節(jié)發(fā)生在淡水湖泊及養(yǎng)殖池塘中，對(duì)生活于水體中的水生生物造成了極大的影響，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖造成了極大的危害。微囊藻毒素是一種肝毒素，主要靶器官為動(dòng)物的肝臟。有研究表明在凡納濱對(duì)蝦池塘中，銅綠微囊藻等藍(lán)藻形成優(yōu)勢(shì)種與蝦病暴發(fā)呈正相關(guān)，對(duì)蝦發(fā)病池呈現(xiàn)硅藻到藍(lán)藻優(yōu)勢(shì)的演替。而在生產(chǎn)中，養(yǎng)殖中后期的蝦池，也經(jīng)常爆發(fā)藍(lán)藻水華，導(dǎo)致蝦類(lèi)原因不明的死亡。暴露于一定濃度銅綠微

2、囊藻的克氏原螯蝦、凡納濱對(duì)蝦和羅氏沼蝦幼蝦存活率顯著降低，外觀顏色及超微結(jié)構(gòu)有明顯變化。
　　凡納濱對(duì)蝦俗名南美白對(duì)蝦，是當(dāng)今世界養(yǎng)殖蝦類(lèi)產(chǎn)量最高的三大品種之一（斑節(jié)對(duì)蝦P.monodon、凡納濱對(duì)蝦L.vannamei和中國(guó)對(duì)蝦F.chinensis）。它具有食性雜、生長(zhǎng)快、繁殖力強(qiáng)、成活率高、易于飼養(yǎng)且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)，所以深受養(yǎng)殖戶(hù)及消費(fèi)者的喜愛(ài)。但由于對(duì)蝦爆發(fā)性疾病的危害使其養(yǎng)殖面臨極高的養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)。雖然經(jīng)過(guò)科學(xué)家、政府和企

3、業(yè)的不懈努力下恢復(fù)了一定的養(yǎng)殖產(chǎn)量，降低了養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)，但對(duì)蝦流行性疾病仍是懸在養(yǎng)殖戶(hù)心頭的一把利劍。因此，深入開(kāi)展凡納濱對(duì)蝦免疫防御機(jī)制的相關(guān)研究，探索免疫防治新途徑，對(duì)實(shí)現(xiàn)其健康養(yǎng)殖和疾病控制有重大意義。
　　本文就目前國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀，對(duì)甲殼動(dòng)物的免疫防御機(jī)制進(jìn)行綜述，分析了甲殼動(dòng)物細(xì)胞免疫及體液免疫等免疫過(guò)程的免疫機(jī)制及其免疫相關(guān)的基因和蛋白。通過(guò)對(duì)凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行血竇注射微囊藻毒素MC-LR染毒，獲取其肝胰腺及血液組織樣品，采用

4、Illumina Hiseq2500測(cè)序方法獲得了凡納濱對(duì)蝦在注射微囊藻毒素前后血液及肝胰腺的轉(zhuǎn)錄組，從微囊藻毒素對(duì)蝦類(lèi)肝胰腺和血淋巴細(xì)胞免疫毒性作用著手，探討微囊藻毒素對(duì)蝦類(lèi)的毒性機(jī)理。并利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)注射微囊藻毒素后的凡納濱對(duì)蝦細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，探討微囊藻毒素注射凡納濱對(duì)蝦過(guò)程中對(duì)蝦肝胰腺細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。并利用激光共聚焦技術(shù)觀察驗(yàn)證細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的發(fā)生。研究結(jié)果如下：
　?。?）在血液和肝胰腺樣本中分別發(fā)現(xiàn)了有顯著性差異表

5、達(dá)的基因序列，經(jīng)過(guò)確定其中包括血液樣本中的血小板反應(yīng)蛋白（thrombospondin）和細(xì)胞周期素B（cyclin B）兩種基因，肝胰腺樣本中的酚氧化酶原（prophenoloxidase）、胰蛋白酶（trypsin）及 C型凝集素（C-type lectin）等10種基因。在轉(zhuǎn)錄本出現(xiàn)顯著性表達(dá)差異結(jié)果中沒(méi)有明顯的細(xì)胞免疫范疇基因出現(xiàn)，酚氧化酶原及 C型凝集素等都屬于體液免疫范疇，不過(guò)在對(duì)蝦免疫系統(tǒng)中細(xì)胞免疫和體液免疫本身就相互作用

6、，密不可分。
　?。?）GO顯著性差異表達(dá)結(jié)果證實(shí)了在血液樣本組中存在細(xì)胞粘附、細(xì)胞殺傷及細(xì)胞粘附分子結(jié)合物等細(xì)胞免疫相關(guān)基因表達(dá)。在肝胰腺樣本組中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞免疫相關(guān)的GO顯著差異性表達(dá)，但值得一提的是其中有不少氧化還原酶及蛋白質(zhì)代謝相關(guān)的GO顯著性差異表達(dá)。KEGGPATHWAY顯著性差異表達(dá)結(jié)果表明，在血液樣本組和肝胰腺樣本組中都存在吞噬體（Phagosome）、細(xì)胞凋亡（Apoptosis）、內(nèi)吞作用（Endocyt

7、osis）和細(xì)胞粘附分子（Cell adhesion molecules（CAMs））等通路。
　?。?）流式細(xì)胞儀檢測(cè)PI單染的微囊藻毒素注射凡納濱對(duì)蝦肝胰腺細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在注射微囊藻毒素后有明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象發(fā)生，在12h內(nèi)緩慢增長(zhǎng)，12至24h增長(zhǎng)較快，24h后這個(gè)趨勢(shì)明顯的放緩了。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了在微囊藻毒素感染的情況下凡納濱對(duì)蝦細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的存在，并且與注射后感染時(shí)間存在一定的關(guān)系。
　?。?）激光共聚焦觀察細(xì)胞