根癌農(nóng)桿菌介導的酸櫻桃離體葉片高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、核果類果樹主要包括桃、李、杏、扁桃、櫻桃等，在植物分類上屬于薔薇科(Rosaceae)李屬(Prunus L.)植物，在果樹生產(chǎn)中占有相當重要的地位。長期以來，核果類果樹一直被國內(nèi)外同行公認為是最難進行離體(無性材料)再生的一類樹種，大家在這方面曾經(jīng)嘗試做過大量實驗研究，但成效甚微。核果類果樹由于其自身的離體再生困難等問題，基因工程技術(shù)的研究也明顯地相對落后于其它果樹的發(fā)展。因此，建立和完善有效的遺傳轉(zhuǎn)化再生系統(tǒng)就成為開展核果類果樹在這

2、一領域研究的關鍵。長期以來，國內(nèi)外的幾個實驗室一直致力于這方面的研究，并取得了一定的研究成果。種種跡象表明，核果類果樹(無性材料)遺傳轉(zhuǎn)化高效再生技術(shù)有望在近期取得突破。 櫻桃是一年當中最早上市的水果，俗有春果第一枝的美譽。其營養(yǎng)價值高，用途廣。除鮮食外還可以做點心、釀酒、入藥等功能。酸櫻桃還具有調(diào)中益氣、養(yǎng)精止瀉等滋補功能。其葉、核、果皆可入藥，通身無棄物。由于多元酚類化合物含量較高，因此有明顯的抗癌、抗動脈硬化和其他心血管疾

3、病的功效。然而在栽植當中容易感染根癌病，大大限制了該優(yōu)良樹種的推廣，因而提高它的抗逆性是今后發(fā)展的目標。傳統(tǒng)的育種方法周期長，而基因工程為加快其育種進程提供了新的手段。但是缺乏高效遺傳轉(zhuǎn)化體系，為建立櫻桃優(yōu)良的遺傳轉(zhuǎn)化體系，本論文以酸櫻桃為材料，用離體葉片作為外植體，建立了離體葉片高頻再生體系;并通過根癌農(nóng)桿菌介導從優(yōu)化遺傳轉(zhuǎn)化的各項參數(shù)，建立了離體葉片高效遺傳轉(zhuǎn)化體系，其結(jié)果如下: 1.確定酸櫻桃離體葉片的再生體系從再生培養(yǎng)基

4、、激素配比、葉片生理狀態(tài)、培養(yǎng)基中瓊脂用量、不同培養(yǎng)容器等幾個方面對影響離體葉片高效再生的關鍵因素進行了研究。確定了CAB-6p的再生培養(yǎng)基為WPM，最佳激素配比是BA 2mg/L+IAA 2mg/L，葉片的最佳生理狀態(tài)為試管苗頂部新發(fā)出的極為幼嫩并且是合攏狀態(tài)的幼葉，瓊脂的使用濃度為4.5g/L，離體葉片誘導再生的培養(yǎng)容器用廣口瓶再生效果最好。 2.酸櫻桃遺傳轉(zhuǎn)化中對抗生素抗性敏感性試驗的研究驗研究表明，卡那霉素的篩選最佳濃度

5、應為40mg/1。認為頭孢唑啉鈉是CAB-6p的最佳抑菌抗生素，且適宜的濃度范圍為500mg/1-600mg/1。 3.酸櫻桃遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立用無菌的CAB-6p試管苗的離體葉片作為受體，優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化體系的多項參數(shù):以0D500為0.5-1.0的農(nóng)桿菌菌液侵染10min后共培養(yǎng)3天，能獲得的GUS+率高達80％以上。 4.本實驗還進一步研究了立即篩選、延遲篩選、梯度篩選三種選擇方式對抗性芽的百分率及轉(zhuǎn)化率的影響