根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小鹽芥(Thellungiella halophila)遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、土壤鹽漬化是一個(gè)全球性的資源和生態(tài)問(wèn)題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球目前有各種鹽漬化土地約9.5億h㎡并有擴(kuò)大的趨勢(shì)，我國(guó)土壤鹽漬化形勢(shì)也十分嚴(yán)峻。土壤鹽漬化對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)尤其是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有較大的影響，解決土壤鹽漬化問(wèn)題十分重要和緊迫。通過(guò)生物技術(shù)手段解決土壤鹽漬化問(wèn)題較傳統(tǒng)方法具有成本低、保護(hù)環(huán)境等優(yōu)勢(shì)，因此，具有廣闊的前景。
　　 小鹽芥為十字花科（Cruciferae）鹽芥屬（Thellungiella）一年生草本植物。小鹽芥與模式植物擬南芥（

2、Arabidopsis）有很多相似的特征：植株矮小、生長(zhǎng)期短、種子豐富、自花受粉等。小鹽芥與擬南芥同屬十字花科，而且近緣，在cDNA水平上，兩者有90％以上的同源序列，因此，便于利用擬南芥的基因組序列。此外，作為鹽生植物，較低鹽濃度能使小鹽芥鮮重、干重和光合速率增長(zhǎng)，在300mMNaCl條件下，小鹽芥能完成生活史，小鹽芥還能在高鹽環(huán)境下（500mMNaCl）生存，此外，小鹽芥還耐-15℃低溫和干旱。因此，小鹽芥在植物耐鹽機(jī)理方面具有潛在

3、的理論和實(shí)踐價(jià)值，近年來(lái)開始作為耐鹽模式植物。
　　 根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens） Ti（tumor-inducing plasmid）質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是目前研究得最多、機(jī)理最清楚、技術(shù)方法最成熟的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)之一。迄今所獲得的近200種轉(zhuǎn)基因植物中，80％以上是通過(guò)根癌農(nóng)桿菌系統(tǒng)轉(zhuǎn)化獲得的。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法有多種，其中葉盤法是雙子葉植物較為常用也較為簡(jiǎn)單有效的方法。
　　 本

4、實(shí)驗(yàn)的目的在于建立小鹽芥的遺傳轉(zhuǎn)化體系。本實(shí)驗(yàn)研究了次氯酸鈉（NaClO）不同消毒時(shí)間對(duì)外植體污染率的影響和不同的植物激素及不同濃度對(duì)小鹽芥愈傷組織的誘導(dǎo)、不定芽分化的影響；本實(shí)驗(yàn)還研究了乙酰丁香酮添加方式、共培養(yǎng)時(shí)間和選擇壓的大小對(duì)根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小鹽芥的影響，以及外植體上所附根癌農(nóng)桿菌的處理方法，從而為建立高效的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系奠定基礎(chǔ)。
　　 本實(shí)驗(yàn)以葉柄為外植體，經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化、生根和移栽建立了小鹽芥的再生體

5、系；在此基礎(chǔ)上，通過(guò)預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)和GUS組織化學(xué)染色檢測(cè)，初步建立了小鹽芥的遺傳轉(zhuǎn)化體系。本實(shí)驗(yàn)主要研究結(jié)果如下：
　　 （1）小鹽芥愈傷誘導(dǎo)和芽分化培養(yǎng)基為MS+2.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA，芽分化需30d，芽分化率為67％。生根培養(yǎng)基為1/2MS，15d生根。6-BA與2，4-D組合可誘導(dǎo)愈傷但不能分化出芽。
　　 （2）預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS+2.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA，預(yù)

6、培養(yǎng)需3d。根癌農(nóng)桿菌菌液OD600=0.5侵染5min。共培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS+2.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+19.6mg/LAS，暗培養(yǎng)3d。共培養(yǎng)時(shí)間低于3d不利于農(nóng)桿菌充分侵染，多于3d則會(huì)造成農(nóng)桿菌大量繁殖損傷外植體。選擇培養(yǎng)基為MS+2.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+300mg/LCef+10mg/LHyg。生根培養(yǎng)基為1/2MS+300mg/LCef+10mg/LHyg。
　　 （3）選擇培