四種重要養(yǎng)殖貝類有效繁殖群體數(shù)量研究.pdf

1、我國是海水養(yǎng)殖大國,海洋貝類的養(yǎng)殖是其中重要的組成部分。對于養(yǎng)殖群體來說,較低的有效群體大小(或有效繁殖群體大小)會使得群體的遺傳多樣性降低,增加近交和遺傳漂變的比率,特別在貝類等高產(chǎn)卵能力的生物中,使用較少的親本即可以獲得足夠的苗種,育苗所用的有效繁殖群體數(shù)量對養(yǎng)殖群體的遺傳結(jié)構(gòu)具有重要影響。本研究以分子遺傳學(xué)理論為基礎(chǔ),在貝類中進行遺傳標(biāo)記的開發(fā)并檢測了他們在家系鑒定中的效率。此外,應(yīng)用分子家系鑒定的方法,調(diào)查了北方沿海四種具有不同

2、生活方式的重要經(jīng)濟貝類:太平洋牡蠣(固著型),海灣扇貝(雌雄同體底棲型),蝦夷扇貝(雌雄異體底棲型),魁蚶(埋棲型)等在常規(guī)苗種繁育過程中有效繁殖群體的大小、遺傳多樣性的變化以及近交程度,旨在為我國海水養(yǎng)殖貝類遺傳多樣性保護和健康苗種培育提供指導(dǎo)依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.海灣扇貝EST-SSR標(biāo)記分離及特性分析
　　 利用公共數(shù)據(jù)庫資源,在海灣扇貝EST數(shù)據(jù)庫中查找包含微衛(wèi)星的序列,開發(fā)了15個EST-SSR分

3、子標(biāo)記,采用群體多態(tài)性分析結(jié)果顯示,位點的等位基因數(shù)平均值為5.5,觀測和期望雜合度范圍分別為0.000-0.781和0.155-0.885。平均多態(tài)信息含量為0.548。進行Bonferroni校正后,發(fā)現(xiàn)15個位點中有8個位點顯著偏離哈迪-溫伯格平衡。在各位點之間未發(fā)現(xiàn)有連鎖現(xiàn)象。5個多態(tài)性最高的微衛(wèi)星位點在己知單親時的累積排除概率超過99％。利用篩選出的15對引物在櫛孔扇貝、蝦夷扇貝和長肋日月貝中進行PCR擴增,其中9對引物在櫛孔

4、扇貝和蝦夷扇貝中能擴增出產(chǎn)物,有5對引物擴出的微衛(wèi)星標(biāo)記呈多態(tài)。在長肋日月貝中有3對引物有擴增產(chǎn)物,有1對引物擴出的微衛(wèi)星標(biāo)記呈多態(tài)。
　　 2.海灣扇貝EST-SNP標(biāo)記分離及特性分析
　　 通過對海灣扇貝EST數(shù)據(jù)庫中4968條ESTs進行聚類及拼接后,共發(fā)現(xiàn)3905個候選SNP位點,平均密度為1/118.2bp。從中選擇30個候選SNPs進行tetra-primer ARMS-PCR引物設(shè)計和優(yōu)化,17組引物擴增產(chǎn)

5、生與預(yù)期片段長度相符的多態(tài)性位點,多態(tài)性位點最小等位基因頻率從0.016到0.484。對含有17個多態(tài)SNPs的contigs序列在GenBank中進行BLASTX比對,除一個位點所在序列外均有匹配的功能序列,其中11個已驗證SNPs定位于編碼區(qū)(外顯子區(qū)),導(dǎo)致同義氨基酸替換。家系模擬鑒定結(jié)果表明,SNP標(biāo)記對鑒定所用親本的數(shù)量比微衛(wèi)星標(biāo)記更為敏感,因此需要更多的SNPs來抵消多態(tài)性低帶來的負(fù)面效果以達(dá)到較高并且穩(wěn)定性較好的鑒定成功率

6、。通過對海灣扇貝EST數(shù)據(jù)庫的分析構(gòu)建了最優(yōu)密碼子使用表,以解釋某一特定SNP不同等位基因頻率上的差異,分析發(fā)現(xiàn)對密碼子使用的選擇性可能會影響編碼區(qū)SNP不同等位基因的頻率。這些對于海灣扇貝SNP的初步研究是對現(xiàn)有遺傳標(biāo)記的有用補充。
　　 3.基于微衛(wèi)星家系分析的海灣扇貝交配系統(tǒng)和繁殖成功研究
　　 運用微衛(wèi)星家系鑒定的方法對群體產(chǎn)卵海灣扇貝的交配系統(tǒng)進行了研究。對14個候選親本和237個子代的鑒定結(jié)果表明,采用6個多

7、態(tài)微衛(wèi)星位點能夠?qū)?5％的子代鑒定到親本。根據(jù)家系鑒定結(jié)果,發(fā)現(xiàn)既有通過自體受精產(chǎn)生的子代也有通過非自體受精產(chǎn)生的子代,但是自體受精率在親本個體間巨大的變異表明海灣扇貝具有混合交配模式。繁殖成功的變異造成了有效繁殖親本數(shù)量的降低(Nb/N=0.71)。群體的自體受精率為32.89％,近交系數(shù)為16.5％。在不考慮自交子代的情況下,半同胞和非同胞親本在親緣關(guān)系和繁殖成功之間沒有顯著的相關(guān)關(guān)系,表明可能是選擇的壓力而不是對近交的避免機制支持

8、著海灣扇貝自交兼容性交配系統(tǒng)的進化和維持。本研究結(jié)果使我們對目前我國海灣扇貝的養(yǎng)殖狀況有了深入了解,并且為以后對其進行繁殖技術(shù)改良提供了知識基礎(chǔ)。
　　 4.太平洋牡蠣EST-SSR多重PCR的開發(fā)及其在家系鑒定中的檢驗
　　 我們從以往報道的太平洋牡蠣EST-SSRs中開發(fā)出了4組multiplex PCRs,并在12組單對交配家系中檢驗了其在家系鑒定中的效率。位點的基因豐富度和多態(tài)信息含量平均值分別為11.1和0.8

9、11,4組multiplex PCRs在家系鑒定中的累積排除能力大于99.99％。對143組分離模式的分析發(fā)現(xiàn),有11個基因型分離比偏離孟德爾分離定律。通過分析位點在家系內(nèi)的Mendelian分離模式,發(fā)現(xiàn)無效等位基因頻率為4.9％。對12組單對交配家系的實際鑒定結(jié)果表明,使用2組多態(tài)信息含量最高的Multiplex PCRs,可以將97％的子代鑒定到親本,其結(jié)果與真實的家系信息對比,錯誤率為4％;如果使用3組或者4組Multiplex

10、PCRs,則可以將100％的子代鑒定到親本,與真實的家系信息對比錯誤率為0。
　　 5.太平洋牡蠣養(yǎng)殖群體的微衛(wèi)星家系分析和有效群體大小估算
　　 運用7個高度多態(tài)的微衛(wèi)星位點對群體產(chǎn)卵的太平洋牡蠣進行家系分析,并比較親本和子代的遺傳多樣性變化。對8個候選母本、6個候選父本和155個子代的鑒定結(jié)果與模擬鑒定一致,運用6個微衛(wèi)星位點即可獲得超過99％的鑒定成功率。等位基因數(shù)和觀察雜合度(Ho)在親本和子代中沒有明顯差異,但

11、是,子代的期望雜合度(He)和親本相比有顯著降低。雖然所有親本均參與子代繁殖過程,但是親本繁殖成功的變異和不平衡的性別比例導(dǎo)致了Ne的降低(Ne=11.42)。群體近交率的估算值為16.5％。這些結(jié)果表明在未來制定太平洋牡蠣群產(chǎn)育種方案時,需要考慮到較高的近交率和較低有效群體的因素。
　　 6.基于微衛(wèi)星家系分析的蝦夷扇貝有效繁殖群體研究
　　 運用微衛(wèi)星家系鑒定的方法對群體產(chǎn)卵蝦夷扇貝幼蟲發(fā)育兩個不同時期的有效繁殖群體

12、的變化及其與親本性狀特征的相關(guān)性進行了研究。對14個候選母本、14個候選父本和1080個子代的鑒定結(jié)果表明,采用5個多態(tài)微衛(wèi)星位點能夠獲得97％以上的鑒定成功率。親本繁殖成功的變異是D形幼蟲時期有效群體大小降低的主要原因(Ne/N=0.87),近交率的估計為0.081。稚貝時期的有效群體大小進一步降低(Ne/N=0.78),近交率上升至0.090。這一變化可能與育苗過程中的幼蟲分級選擇有關(guān),人為的改變了群體的遺傳結(jié)構(gòu),加劇了親本繁殖成功

13、的變異。也可能與不同親本組子代的存活力差異有關(guān)。回歸分析表明,D形幼蟲階段母本的繁殖成功與母本殼長和殼寬存在顯著正相關(guān)關(guān)系,父本的繁殖成功與父本殼高存在顯著正相關(guān)關(guān)系,由此推斷在群體產(chǎn)卵時,親本個體大小在繁殖成功上有顯著優(yōu)勢。然而在稚貝階段,未檢測到親本的繁殖成功與性狀特點的相關(guān)性。表明隨著苗種的養(yǎng)成,親本個體大小在產(chǎn)卵階段的繁殖成功優(yōu)勢司能會逐漸消失。
　　 7.基于微衛(wèi)星同胞重建的魁蚶有效繁殖群體研究
　　 運用5個

14、微衛(wèi)星標(biāo)記,在沒有親本信息的情況下,采取同胞重建的方法研究了群體產(chǎn)卵魁蚶幼蟲發(fā)育兩個不同時期遺傳多樣性以及有效繁殖群體大小的變化,并對親本的繁殖成功與交配對象數(shù)目的關(guān)系進行了相關(guān)性研究。等位基因數(shù)和觀察雜合度在兩個采樣階段均沒有顯著差異。但是對D形幼蟲時期以及稚貝時期各180個個體的同胞重建結(jié)果表明,D形幼蟲時期有效繁殖群體的估算值為20,稚貝時期有效繁殖群體的估算值為16,出現(xiàn)了明顯的降低,而且稚貝時期可能的親本數(shù)量也比D形幼蟲時期降

15、低了16.13％,△F增加了0.6％。多配繁殖在父/母本中均存在,而且在兩個采樣階段,魁蚶父/母本繁殖成功與交配對象數(shù)量均存在顯著正相關(guān)關(guān)系。
　　 綜上,本研究證明基于微衛(wèi)星的家系分析方法具有較高的鑒定效力。運用5-6個微衛(wèi)星位點即能夠成功地對混合種群進行家系鑒定。在本研究的所有養(yǎng)殖貝類中均檢測到有效繁殖群體數(shù)量(Nb,或有效種群大小Nc)的降低。交配系統(tǒng),不平衡的性別比例,親本貢獻(xiàn)的高度變異以及家系規(guī)模的變異是導(dǎo)致Nb降低的