四種重要傳染病病原體檢測(cè)新技術(shù)研究.pdf

1、[目的]人類進(jìn)入21世紀(jì)，感染性疾病仍然是危害人類健康的重要疾患，SARS等新發(fā)傳染病的暴發(fā)和流行構(gòu)成了嚴(yán)重公共衛(wèi)生，社會(huì)和經(jīng)濟(jì)問(wèn)題?？焖佟㈧`敏、特異的檢測(cè)病原體是預(yù)防和控制新發(fā)傳染病暴發(fā)的重要保證。本文的研究目的是建立檢測(cè)SARS冠狀病毒、出血性大腸桿菌O157：H7、霍亂弧菌O139、炭疽芽孢桿菌等四種重要病原體的快速、特異的檢測(cè)方法，為臨床診斷、食品安全檢測(cè)、環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測(cè)、反恐和出入境檢疫等提供有效的檢測(cè)手段。 [內(nèi)容]S

2、ARS冠狀病毒酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的建立；SARS冠狀病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立；霍亂弧菌O139實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的建立；大腸桿菌O157：H7實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的建立；炭疽桿菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的建立。 [方法]克隆表達(dá)SARS結(jié)構(gòu)蛋白并應(yīng)用蛋白芯片技術(shù)篩選特異抗原，在獲得特異抗原基礎(chǔ)上，進(jìn)行SARS冠狀病毒雙抗原夾心法ELISA試劑的研制，并以SARS陽(yáng)性和陰性血清作為企業(yè)質(zhì)控品對(duì)ELISA試劑進(jìn)行

3、優(yōu)化。根據(jù)本室專利技術(shù)-復(fù)合探針熒光定量技術(shù)分析原理，以各病原體的特異基因?yàn)榘行蛄校O(shè)計(jì)合成引物和探針，對(duì)相應(yīng)病原體進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，并探討核酸提取方法、鎂離子濃度、退火溫度、探針濃度等因素對(duì)定量PCR結(jié)果的影響。 [結(jié)果]成功表達(dá)M、N、S等結(jié)構(gòu)蛋白及其相應(yīng)肽段，蛋白芯片篩選結(jié)果表明位于N蛋白C末端的N2蛋白的特異性最強(qiáng)，以該蛋白為抗原研制了雙抗原夾心ELISA試劑。試劑盒的cutoff值為0.15，檢測(cè)中檢所的特異

4、性標(biāo)準(zhǔn)品(20份陰性血清及18份陽(yáng)性血清)均合格；檢測(cè)中檢所的靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品，64倍稀釋后仍為陽(yáng)性；三批試劑檢測(cè)的批內(nèi)、批間變異系數(shù)差異均小于5％。試劑盒臨床考核結(jié)果顯示，對(duì)442例臨床確診的SARS患者血清樣本的平均陽(yáng)性檢出率為70％；對(duì)302份SARS康復(fù)患者隨訪血清樣本的陽(yáng)性檢出率為76％；對(duì)2726例SARS陰性血清樣本的檢測(cè)僅出現(xiàn)2例假陽(yáng)性反應(yīng)。 SARS-CoV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR定量檢測(cè)的最佳鎂離子濃度為4mmol/

5、L,退火溫度為55℃，退火時(shí)間為20s。該方法可檢出5拷貝體外轉(zhuǎn)錄RNA分子，可對(duì)濃度介于106copies/μl-101copies/μl之間的樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量，檢測(cè)20份陰性血清及20份健康志愿者漱口水結(jié)果均為陰性；多次重復(fù)檢測(cè)，Ct值的CV值小于2％。并建立了一種快速、高效的核酸提取方法-磁珠法，并具有操作簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)點(diǎn)。對(duì)臨床確診的42份SARS病人血清和漱口水標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，該方法的檢出率為79％，與熒光抗體檢測(cè)法的符合率為

6、70％。 霍亂弧菌O139實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測(cè)的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件優(yōu)化結(jié)果：3％甲酰胺，Mg2+5mmol/L,引物0.5μmol/L,熒光探針200nmol/L,淬滅探針400nmol/L，退火溫度55℃，退火時(shí)間20s。確定以Chelex法提取細(xì)菌DNA。該法檢測(cè)85株陽(yáng)性菌株均為陽(yáng)性，78株非O139腸道菌均無(wú)響應(yīng)；可檢測(cè)低至10拷貝的質(zhì)粒DNA分子及10CFU的O139霍亂菌；檢測(cè)質(zhì)粒DNA和O139霍亂菌的批間、批內(nèi)

7、變異系數(shù)均小于5％；可對(duì)濃度介于101-107CFU/ul間的樣品進(jìn)行較為準(zhǔn)確的定量。檢測(cè)人工模擬污染的湖水樣品，最低檢測(cè)限達(dá)100CFU/ml。對(duì)335份臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，共檢出133份為陽(yáng)性，而常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)法，僅檢測(cè)出90份陽(yáng)性。 大腸桿菌O157：H7實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測(cè)的最佳擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件與霍亂弧菌O139的基本一致。13株O157菌株經(jīng)該法檢測(cè)均為陽(yáng)性，而78株非O157腸道菌均為陰性；可檢測(cè)低至1拷貝的質(zhì)粒DN

8、A和1CFU的細(xì)菌，并可對(duì)濃度介于100-106CFU/ul間的細(xì)菌進(jìn)行定量；檢測(cè)質(zhì)粒DNA和細(xì)菌核酸的批間和批內(nèi)變異系數(shù)均小于5％。在模擬污染的牛奶中，最低可檢出1×103CFU/ml的細(xì)菌，在果汁和土壤中，最低可檢出1×104CFU/ml的細(xì)菌。 炭疽桿菌實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測(cè)的方法，檢測(cè)10株炭疽菌株均為陽(yáng)性，10株其它菌株均無(wú)響應(yīng)；可檢測(cè)低至1拷貝的質(zhì)粒DNA，1CFU的細(xì)菌及10CFU的芽孢；定量線性范圍為101-10

9、6CFU/ul；批間批內(nèi)變異系數(shù)均小于5％。在模擬污染的鼻拭子中，最低可檢出1×103CFU/ml的芽孢，在模擬奶粉和面粉中，最低可檢出1×103CFU/ml/0.1g的細(xì)菌，而在模擬土壤中，可檢出1×104CFU/ml/0.1g的細(xì)菌。 [結(jié)論]所研制的冠狀病毒雙抗原夾心法ELISA試劑盒敏感性較高，重復(fù)性、特異性良好，可作為SARS確診的輔助診斷工具，對(duì)SARS疫情的預(yù)防和控制有指導(dǎo)意義。復(fù)合探針熒光定量PCR技術(shù)能夠快速準(zhǔn)