烷烴的微生物降解及其羥化酶基因的克隆與表達.pdf

1、從我國東海近海污泥中分離篩選出一株高效降解烷烴的細菌,經(jīng)形態(tài)、生理生化特性及其16S rDNA序列分析,將此菌株初步鑒定為食堿菌屬(Alcanivorax sp.),命名為285。菌株285為革蘭氏陰性,球形,能產生物表面活性劑,不能利用葡萄糖、蔗糖等碳源,以酵母粉為唯一氮源時生長較好。菌株285能夠在96h內完全降解500 mg/L正十八烷,降解正十八烷的最適溫度是30～37℃,最適pH值為6.0～7.0,最適NaCl濃度為2％～9％

2、。菌株285能夠降解原油中C13～C30的正構烷烴及姥鮫烷、植烷等支鏈烷烴,在人工海水中降解原油中烷烴的最適溫度是30℃,最適接種量為1％,通氣量越大越好,補加2 g/L NH4NO3和0.25 g/L酵母粉可以明顯地提高原油中烷烴的降解率。由于其較高的烷烴降解率和較廣的烷烴降解譜,菌株285可以應用于海洋石油污染的生物修復。
　　 從山東東營勝利油田油井下的油水混合物中分離篩選出一株嗜熱烷烴降解菌株,經(jīng)形態(tài)、生理生化特性及其1

3、6S rDNA序列分析,將其初步鑒定為土芽孢桿菌屬(Geobacillus sp.),命名為MH-1。菌株MH-1為革蘭氏陽性,長桿狀,能產芽孢。菌株MH-1在培養(yǎng)96h后對正十六烷的降解率達92％以上,降解的最適溫度是70℃,最適pH值為6.0,能夠在6天內降解原油中的大部分中鏈烷烴及部分長鏈烷烴。
　　 首先從菌株285中克隆出alkB基因的保守片段,在此基礎上通過SEFA-PCR方法成功克隆出alkB全長基因及其上、下游序

4、列。氨基酸序列分析表明,該基因與具有完整ORF的Marinobacter sp.ELB17的putitave AlkB具有最高的同源性(65％),與經(jīng)過功能驗證的Alcanivorax borkumensis SK2的AlkB1的同源性為41.9％,存在四個含His的保守基序,分別為Hist-1、Hist-2、Hist-3和HYG-motif。進一步將該基因在P.fluorescens KOB2△1進行異源表達,恢復了P.fluores

5、cens KOB2Δ1降解烷烴的功能,表明該基因就是烷烴羥化酶基因(GenBank登錄號為No.FJ905614),能夠氧化C14和C16烷。通過RT-PCR方法證明該alkB基因能夠在指數(shù)生長期被正十八烷誘導表達。在alkB基因的上、下游序列中分別存在一個與AraC家族轉錄調控蛋白有關序列的同源性達58％的ORF和一個與Shewanella sp.W3-18-1菌株的siderophore-interactingprotein的氨基酸

6、序列的同源性達45％的ORF。
　　 從菌株2B5中成功克隆出細胞色素P450基因及其基因簇,該基因簇包含5個完整的ORF,它們分別與Limnobacter sp.MED105菌株的transcriptional regulator和Alcanivorax dieselolei B-5T菌株的putative ferrodoxin、cytochrome P450 alkanehydroxylase、putative alcoho

7、l dehydrogenas、putative FAD-dependent oxidoreductasefamily protein的氨基酸序列的同源性達73％、98％、99％、99％和99％,將此5個ORF分別命名為transcriptional regulator、fdx、P450、alkJ和fde。通過在E.coli BL21(DE3)中構建多順反子結構fdx、P450和fdr基因的共表達系統(tǒng),檢測P450基因的功能活性,但沒有顯

8、示出活性。
　　 研究了Geobacillus sp.MH-1菌株中的alkB基因及其基因簇。采用普通PCR方法從Geobacillus sp.MH-1中獲得alkB基因的同源物,alkB-geol、alkB-ge04和alkB-ge06,它們分別與Rhodococcus sp.Q15中alkB4、alkB3和alkB2基因高度同源。進一步采用SEFA-PCR的方法,獲得alkB-ge06基因簇的完整序列(GenBank登錄號為

9、No.FJ977899),該基因簇包含putative transporter、alkB-ge06、rubA3、rubA4和putativeregulatory protein。核苷酸和氨基酸序列分析表明,alkB-geo6基因簇的核苷酸序列與Rhodococcus sp.Q15和Rhodococcus sp.NRRL-16531的alkB2的基因簇的序列同源性高達98％。在菌株MH-1的AlkB-geo6中同樣發(fā)現(xiàn)了四個含His的保守