花生耐低溫種質(zhì)篩選及相關(guān)差異表達(dá)基因鑒定.pdf

1、花生是世界重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物,特別在廣大發(fā)展中國(guó)家,是重要的食用植物油和食用蛋白源。溫度是影響花生生長(zhǎng)發(fā)育,限制花生種植地理分布的重要因素之一。篩選耐低溫花生種質(zhì),并分離耐低溫相關(guān)基因?qū)τ谂嘤弋a(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的耐低溫型花生品種,進(jìn)一步提高花生單產(chǎn),擴(kuò)大花生種植面積,具有十分重要的意義。
　　 本研究首先利用55份花生種子進(jìn)行低溫吸脹萌發(fā)試驗(yàn),統(tǒng)計(jì)露白率及芽長(zhǎng)/種長(zhǎng),篩選耐低溫種質(zhì),并通過(guò)近紅外光譜技術(shù)測(cè)定油酸、亞油酸、棕櫚酸、脂肪

2、、蛋白質(zhì)及蔗糖含量,分析花生種子吸脹期間耐低溫性與各項(xiàng)品質(zhì)性狀之間的相關(guān)性。結(jié)果表明:參試花生種質(zhì)在低溫脅迫條件下,露白率≥80％的種質(zhì)有3份、80％＞露白率≥70％的種質(zhì)有3份、70％＞露白率≥160％的種質(zhì)有5份、露白率＜60％的種質(zhì)有43份(占總數(shù)78.18％);芽長(zhǎng)/種長(zhǎng)＞0.5的種質(zhì)有3份、O.5＞芽長(zhǎng)/種長(zhǎng)＞0.4的種質(zhì)有5份、0.4＞芽長(zhǎng)/種長(zhǎng)＞0.3的種質(zhì)有3份、芽長(zhǎng)/種長(zhǎng)＜0.3的種質(zhì)有43份。其中,多粒型種質(zhì)A4的耐

3、低溫性最強(qiáng),露白率為95％、芽長(zhǎng)/種長(zhǎng)為1.50。種子的露白率與芽長(zhǎng)/種長(zhǎng)呈極顯著正相關(guān)、與脂肪含量呈顯著正相關(guān),芽長(zhǎng)/種長(zhǎng)與亞油酸含量呈顯著正相關(guān)、與油酸含量呈顯著負(fù)相關(guān),但這兩項(xiàng)指標(biāo)與百仁重相關(guān)性均不顯著。
　　 將耐低溫性最強(qiáng)的花生種質(zhì)A4,分別進(jìn)行2℃吸脹處理和田間正常播種時(shí)的溫度15℃進(jìn)行吸脹處理,取吸脹1h,6h和24h的花生樣品,提取花生種子的總RNA,并分離與純化mRNA,采用PCR-SelectTM cDNA

4、Subtraction Kit構(gòu)建3個(gè)低溫脅迫下的抑制差減雜交文庫(kù)(SSH cDNA文庫(kù)),分別標(biāo)記為A庫(kù)、B庫(kù)和C庫(kù)。3個(gè)文庫(kù)分別隨機(jī)挑選500個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序,成功測(cè)序的條數(shù)分別為336,429和466。經(jīng)序列組裝,A庫(kù)獲得8個(gè)unigenes,其中7個(gè)contig和1個(gè)singlet;B庫(kù)獲得18個(gè)unigenes,其中14個(gè)contig和4個(gè)singlet;C庫(kù)獲得193個(gè)unigenes,其中73個(gè)contig和120個(gè)sing

5、let。通過(guò)BLAST2GO軟件與GenBank中的非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(non-redundant protein database)進(jìn)行比對(duì)和功能注釋,其中,A庫(kù)7個(gè)unigene有相關(guān)同源信息,B庫(kù)14個(gè)unigene有相關(guān)同源信息,C庫(kù)132個(gè)unigene有相關(guān)同源信息?；蚬δ苤饕婕暗睫D(zhuǎn)錄調(diào)控、能量代謝、脅迫防御、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞保護(hù)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和生物合成等方面。
　　 從3個(gè)文庫(kù)中獲得的重組克隆中,根據(jù)比對(duì)和注釋的結(jié)果,

6、挑選了14個(gè)感興趣的基因,驗(yàn)證其在正常溫度處理下和低溫脅迫處理下,基因的差異表達(dá)情況。用熒光實(shí)時(shí)定量PCR的方法進(jìn)行驗(yàn)證,采用2-△△Ct的方法,每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次取平均值。經(jīng)驗(yàn)證,這14個(gè)基因在2℃低溫脅迫處理?xiàng)l件下的表達(dá)量是對(duì)照處理15℃情況下的2.85-12.85倍不等。
　　 選取4個(gè)經(jīng)驗(yàn)證確實(shí)與植物耐低溫相關(guān)的基因,利用RACE的方法獲得全長(zhǎng)序列,它們是LEA(胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白)基因、Oleosin(油質(zhì)蛋白)基因、

7、NAC轉(zhuǎn)錄因子以及MYB轉(zhuǎn)錄因子。其中,MYB基因是首次在花生上分離出來(lái)。經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn),本實(shí)驗(yàn)中所克隆LEA序列長(zhǎng)度為1526bp,編碼155個(gè)氨基酸;Oleosin序列長(zhǎng)度為760bp,編碼176個(gè)氨基酸;NAC序列長(zhǎng)度為1406bp,編碼301個(gè)氨基酸;MYB序列長(zhǎng)度為1365bp,編碼344個(gè)氨基酸。并用生物信息學(xué)軟件分別預(yù)測(cè)了其編碼蛋白的物理化學(xué)性質(zhì),功能結(jié)構(gòu)域,活性位點(diǎn)以及二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)。這些工作為通過(guò)gene knock-