金盞菊再生體系的建立和遺傳轉(zhuǎn)化初探.pdf

1、金盞菊(Calendula officinalis L.)為菊科金盞菊屬植物,一年生或越年生草本。金盞菊原產(chǎn)歐洲,在歐洲栽培歷史較長,廣泛用于家庭小花園和盆栽觀賞。在城市街旁的栽植槽和零星墻角花壇中,金盞菊是早春主角之一。我國金盞菊的栽培,是18世紀(jì)后從國外傳入的,新中國成立后,金盞菊在園林中廣泛栽培,應(yīng)用于盆栽觀賞和花壇布置。20世紀(jì)80年代后重瓣、大花和矮生金盞菊引入我國,金盞菊的面貌煥然一新,現(xiàn)已成為我國重要草本花卉之一。除了作為

2、園林觀賞花卉以外,金盞菊還是一種很有發(fā)展前途的經(jīng)濟(jì)植物,可作為很好的化妝品、藥品等。但金盞菊特別容易遭受蟲害,尤其是在早春花期,這就在一定程度上制約了金盞菊的應(yīng)用和推廣。通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法,將胰蛋白酶抑制劑基因Cpkti轉(zhuǎn)入金盞菊基因組中,培育出具有抗蟲功能的新品種,并為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良金盞菊品種的廣泛運(yùn)用打下基礎(chǔ),對(duì)金盞菊在全國大面積推廣應(yīng)用,更好的為園林綠化服務(wù)具有重要意義。
　　 本研究以金盞菊葉片外植體為供試材料

3、,初步探討了金盞菊再生體系和根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化的體系。其主要研究結(jié)果如下:
　　 1金盞菊再生體系的建立
　　 以金盞菊的幼嫩葉片為外植體,以MS為基本培養(yǎng)基,通過添加不同濃度的6-BA和NAA設(shè)計(jì)不同的培養(yǎng)基,研究金盞菊葉盤的最適分化條件。從而初步建立了金盞菊的再生體系。葉片表面滅菌方式為:先75％乙醇浸泡30s,然后0.1％升汞浸泡10 min。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+6-BA1mg/L+NAA0.1mg/

4、L+3％蔗糖+7 g/L卡拉膠,愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)100％;分化培養(yǎng)基為:MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+3％蔗糖+7 g/L卡拉膠,分化率可達(dá)90％,繁殖系數(shù)為4.5。生根培養(yǎng)基為:1/2MS+NAA0.1mg/L+3％蔗糖+7g/L卡拉膠,經(jīng)過12天左右可誘導(dǎo)出根,生根率可達(dá)100％。
　　 2金盞菊遺傳轉(zhuǎn)化體系的初步研究
　　 在建立了金盞菊再生體系的基礎(chǔ)上,對(duì)金盞菊進(jìn)行了抗生素的敏感性試驗(yàn),結(jié)

5、果表明:金盞菊對(duì)卡那霉素比較敏感,培養(yǎng)基中添加10 mg/L卡那霉素,能抑制葉盤分化,培養(yǎng)基中添加10 mg/L卡那霉素,無菌苗難以生根。因此,10 mg/L卡那霉素可以作為篩選培養(yǎng)基中的抗生素配方;實(shí)驗(yàn)表明,500～300mg/L濃度的羧芐青霉素能有效的抑制農(nóng)桿菌的生長,而且?guī)缀醪挥绊懭~片外植體的再生率和不定芽數(shù),可作為金盞菊的抑菌性抗生素。
　　 以金盞菊無菌苗的葉片作為外植體,并利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法將胰蛋白酶抑制

6、劑基因Cpkti轉(zhuǎn)入金盞菊中,對(duì)影響轉(zhuǎn)化效率的因素進(jìn)行了初步研究,探討了預(yù)培養(yǎng)時(shí)間,農(nóng)桿菌菌液濃度,侵染時(shí)間,共培養(yǎng)時(shí)間,以及延遲篩選時(shí)間對(duì)金盞菊遺傳轉(zhuǎn)化的影響。結(jié)果表明以上因素是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的金盞菊遺傳轉(zhuǎn)化的重要影響因素。優(yōu)化后的遺傳轉(zhuǎn)化體系為:將第二次活化后OD600值為1.0的農(nóng)桿菌菌液離心后收集菌體,加入液體MS+AS100um/L+MES0.1％(PH=7.0),重懸到OD600值為0.4～0.5。將預(yù)培養(yǎng)2d的葉盤置于重懸后的

7、菌液中侵染15min,在MS+6-BA1mg/L+NAA0.1mg/L的共培養(yǎng)基中,暗培養(yǎng)2d;振蕩脫菌30min后,在分化培養(yǎng)基中延遲培養(yǎng)2d,按5 mg/L-10 mg/L卡那霉素逐漸遞增的方式連續(xù)篩選直至有不定芽生成。羧芐青霉素的濃度開始時(shí)為500mg/L,后期為300mg/L?？剐匝吭谔砑?0mg/L卡那霉素的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。對(duì)所得抗性植株進(jìn)行GUS瞬時(shí)表達(dá)檢測和PCR擴(kuò)增檢測表明:胰蛋白酶抑制劑基因已成功轉(zhuǎn)入金盞菊中