小麥再生體系的建立及遺傳轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、小麥?zhǔn)侵匾募Z食作物，利用植物基因工程技術(shù)進(jìn)行小麥遺傳改良是小麥遺傳育種的新方向。本文以豫麥34、矮抗58、百麥4411、百麥0566、百農(nóng)64、百麥1號(hào)、抗凍早-30、06-4046八個(gè)小麥品種(系)的成熟胚為起始外植體，通過胚性愈傷組織誘導(dǎo)及分化，建立其植株再生體系。在此基礎(chǔ)上，探討了農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行成熟胚愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的可行性。另外，本研究還對(duì)花粉管通道法和農(nóng)桿菌菌液滴沾小花法對(duì)小麥整株轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行了初步研究。 本研究

2、主要研究結(jié)果如下： 1、從上述八個(gè)小麥品種中篩選出了愈傷組織誘導(dǎo)率高、分化再生能力較強(qiáng)、成苗率較高的三個(gè)基因型(即豫麥34、矮抗58及百麥1號(hào))，建立了高效穩(wěn)定的植株再生體系。以下因素對(duì)小麥再生有較大影響。 ①光照：在全黑暗培養(yǎng)條件下胚狀體誘導(dǎo)率要明顯高于光照培養(yǎng)。 ②溫度：在26℃條件下對(duì)胚狀體誘導(dǎo)和分化再生苗均表現(xiàn)較好，且此溫度下愈傷組織大多為淡黃色，質(zhì)地較硬，生長狀態(tài)好。 ③繼代時(shí)間：頻繁繼代可保持

3、較高的胚狀體誘導(dǎo)率，一般5～7天繼代一次對(duì)于防止褐化有較好效果。 ④有機(jī)物：在誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)基中均添加40.mg·L-1的CH(水解酪蛋白)可促進(jìn)胚狀體的發(fā)生及分化。 ⑤激素：誘導(dǎo)培養(yǎng)基中附加2，4-D2 mg·L-1時(shí)有利于胚狀體發(fā)生；與NAA(α-萘乙酸)和6-BA(6-芐基腺嘌呤)的效果相比，分化培養(yǎng)基中附加KT(細(xì)胞激動(dòng)素)時(shí)更有利于胚狀體分化及植株再生，但三個(gè)基因型所需KT的濃度不同，豫麥34和矮抗58在含KT

4、2.0 mg·L-1的培養(yǎng)基中分化再生能力更強(qiáng)，百麥1號(hào)則在含KT0.5 mg·L-1的培養(yǎng)基中分化再生能力更強(qiáng)。 2、對(duì)成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織進(jìn)行組織細(xì)胞學(xué)觀察，結(jié)果顯示：愈傷組織中既含有胚性愈傷，又含有非胚性愈傷，兩者在細(xì)胞結(jié)構(gòu)上存在差異：胚性愈傷組織細(xì)胞核較大，染色較深，細(xì)胞質(zhì)較多，細(xì)胞較小，多為圓型，排列整齊，細(xì)胞間隙較?。环桥咝杂鷤M織細(xì)胞核較小，細(xì)胞個(gè)體較大，液泡較大，多為長型排列雜亂。 3、以豫麥34、矮抗5

5、8、百麥1號(hào)的成熟胚愈傷組織為受體材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-IPT(含有潮霉素(Hyg)篩選基因和GUS報(bào)告基因)上攜帶的外源目的基因IPT導(dǎo)入上述受體中。對(duì)影響其轉(zhuǎn)化率的主要因素進(jìn)行了優(yōu)化，①抗生素選擇壓：豫麥34和百麥1號(hào)其潮霉素選擇壓為50 mg·L-1；矮抗58其潮霉素選擇壓為70 mg·L-1。②菌液濃度和浸染時(shí)間：菌液濃度的梯度試驗(yàn)表明OD600=0.6，侵染30min時(shí)是外植體轉(zhuǎn)化比較有利的組

6、合條件。③預(yù)培養(yǎng)：預(yù)培養(yǎng)3天可以較好的提高轉(zhuǎn)化效率，轉(zhuǎn)化率可達(dá)6.97％。④乙酰丁香酮(AS)：在活化農(nóng)桿菌菌株、共培養(yǎng)基、重懸液(MS)中均加入AS20.μmol·L-1可以較好的提高轉(zhuǎn)化率。 4、利用花粉管通道法將重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-IPT上攜帶的IPT基因?qū)氚?8、抗凍早-30、百麥4411、06-4046和百麥1號(hào)5個(gè)小麥品種(系)。花粉管通道法共處理小花1217朵，收獲T0代種子956粒，結(jié)實(shí)率為78.