棉花在黃萎病侵染早期的蛋白質(zhì)組及表達(dá)譜分析.pdf

1、棉花作為主要的紡織工業(yè)原料,是最重要的經(jīng)濟(jì)作物。棉花黃萎病作為一種維管束病害,每年對(duì)棉花生產(chǎn)造成的損失巨大。我們對(duì)黃萎病菌(Verticilliumdahliae)致病的分子機(jī)理了解的并不多。歷史上對(duì)黃萎病致病機(jī)理存在兩種看起來(lái)相互沖突的觀點(diǎn):一種認(rèn)為黃萎病是由于真菌分泌的毒素導(dǎo)致的,另一種則認(rèn)為黃萎病菌導(dǎo)致的維管束堵塞才是導(dǎo)致病害的原因。
　　 為了深入了解棉花與黃萎病菌相互作用的分子機(jī)制,本論文利用蛋白質(zhì)組學(xué)及表達(dá)譜學(xué)來(lái)探討

2、棉花在黃萎病菌侵染早期的變化。在建立有效接菌體系及蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析基礎(chǔ)上,對(duì)強(qiáng)致病型V.dahliae侵染早期的棉花差異蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行了研究。而V.dahliae按照致病類型可以分為強(qiáng)中弱三種,為了解釋弱致病型V.Dahliae侵染后,棉花無(wú)病理癥狀的原因,使用Solexa測(cè)序表達(dá)譜學(xué)技術(shù)分析了棉花根部的差異表達(dá)基因。
　　 1.適于棉花幼苗蛋白質(zhì)組研究的總蛋白質(zhì)提取方法的建立
　　 為了找到一種適合棉花幼苗的蛋白質(zhì)提

3、取方法,對(duì)四種常用的植物蛋白質(zhì)提取方法進(jìn)行比較。結(jié)果表明:三氯乙酸-丙酮及酚提取法(Method D)提取的蛋白最優(yōu),在雙向電泳(2D)凝膠上的蛋白點(diǎn)也最多(321);丙酮-酚提取法(MethodB)提取的蛋白在2D凝膠上顯示出216個(gè)蛋白點(diǎn);三氯乙酸-丙酮(Method A)提取法則不適于棉花的蛋白質(zhì)提取,僅僅有少許的低分子量蛋白出現(xiàn)在2D凝膠上;酚提取法(Method C)提取的蛋白在2D凝膠上顯示出240個(gè)點(diǎn),但其凝膠背景較高。因

4、此我們選擇Method D,并對(duì)其進(jìn)行了優(yōu)化。利用優(yōu)化的Method D提取的棉花總蛋白,通過(guò)雙向電泳后,用考馬斯亮藍(lán)G-250染色在2D凝膠上可見(jiàn)900多個(gè)蛋白點(diǎn),蛋白點(diǎn)數(shù)比優(yōu)化前增加了約3倍。以上結(jié)果表明優(yōu)化后的Method D更加適合棉花幼苗的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。
　　 優(yōu)化的Method D方法為:首先使用三氯乙酸-丙酮沉淀蛋白質(zhì),去除色素等有機(jī)物質(zhì)。然后進(jìn)行洗滌,使用酚抽兩次提蛋白樣品減少蛋白損失,接著使用提取液抽提酚相去

5、除可能的水溶性物質(zhì)。最后使用醋酸銨甲醇溶液沉淀蛋白質(zhì),并使用甲醇與80％丙酮分別洗滌兩次。
　　 用優(yōu)化的Method D提取V.dahliae侵染前后的棉花葉片總蛋白,然后進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組分析。其中一個(gè)差異蛋白點(diǎn)Flavanone3-hydroxylase(F3H)表現(xiàn)出明顯的上調(diào)表達(dá),進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明傷處理棉花后F3H下游與Proanthocyanidins(Pas)合成相關(guān)的基因多表現(xiàn)為協(xié)同性的上調(diào)表達(dá)。這些結(jié)果表明Pas

6、可能在V.dahliae侵染與傷誘導(dǎo)的棉花中扮演重要作用。然而實(shí)驗(yàn)也表明V.dahliae侵染后,棉花葉片差異蛋白較少。棉花根部可能是更好的V.dahliae與棉花互作研究材料,因?yàn)閂.dahliae侵染是從根部開(kāi)始。
　　 2.V.dahliae侵染早期,棉花根組織的差異蛋白組學(xué)研究
　　 在優(yōu)化的Method D基礎(chǔ)上,建立了一個(gè)適合棉花根部蛋白組提取方法。V.dahliae侵染棉花后棉花根部組織材料在0 h,24

7、h與72 h分別被收集,并提取蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向電泳,平均有830±11蛋白點(diǎn)在凝膠上被檢測(cè)到。進(jìn)一步通過(guò)質(zhì)譜鑒定了34個(gè)差異表達(dá)蛋白的肽指紋圖譜(Peptide-mass fingerprinting,PMF)。因?yàn)槿狈γ藁ǖ幕蚪M序列,我們?cè)跀?shù)據(jù)鑒定時(shí)以高等植物的數(shù)據(jù)庫(kù)為比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)。有15個(gè)蛋白點(diǎn)被鑒定,其中1個(gè)上調(diào)表達(dá),10個(gè)下調(diào)表達(dá),4個(gè)表現(xiàn)為臨時(shí)上調(diào)表達(dá)。按照功能分,這些蛋白包括病原相關(guān)蛋白、活性氧(Reactive oxygen

8、 species,ROS)調(diào)節(jié)蛋白、折疊與修飾相關(guān)蛋白、糖與能量代謝相關(guān)蛋白及一些其它蛋白。
　　 總的來(lái)看,棉花受V.dahliae侵染后,首先建立早期的防御反應(yīng)(如PR蛋白及ROS)。然而這并不足以有效保護(hù)棉花,V.dahliae可能通過(guò)抑制或者破壞防御相關(guān)基因的表達(dá)從而成功侵入棉花,棉花的正常生理功能很快被破壞,一些蛋白表現(xiàn)為明顯的下調(diào)(如糖與能量代謝相關(guān)蛋白,折疊與修飾相關(guān)蛋白及細(xì)胞骨架蛋白)。
　　 3.與活性

9、氧及細(xì)胞死亡相關(guān)的毒素抑制試驗(yàn)
　　 前述蛋白質(zhì)研究表明棉花受V.dahliae侵染后,早期的一個(gè)防御反應(yīng)與ROS相關(guān),在此通過(guò)植物組織染色進(jìn)一步證實(shí)了V.dahliae的侵染導(dǎo)致棉花微管組織內(nèi)的ROS及細(xì)胞死亡。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)還表明V.dahliae的上清液?jiǎn)为?dú)就能導(dǎo)致葉片的萎焉壞死。
　　 為了驗(yàn)證V.dahliae毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是否是通過(guò)主動(dòng)調(diào)控植物而造成的,我們通過(guò)蛋白合成抑制劑(Cycloheximide,C

10、HX)注射煙草葉片,實(shí)驗(yàn)表明CHX能有效延遲毒素導(dǎo)致的葉片壞死斑形成。然而ROS抑制劑(Diphenyleneiodoniumchloride,DPI)及蛋白酶體抑制劑(Z-Leu-Leu-Leu-al,MG132)并不能阻止毒素導(dǎo)致的葉片壞死。這些結(jié)果告訴我們V.dahliae毒素是通過(guò)積極調(diào)控宿主蛋白質(zhì)的合成來(lái)誘導(dǎo)植物細(xì)胞死亡的,但這些調(diào)控并不是已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)的活性氧突發(fā)或者泛素/26S蛋白酶體途徑(ubiquitin/26S pro

11、teasome system)。
　　 此外,V.dahliae毒素能在老葉片上快速導(dǎo)致細(xì)胞壞死,而在嫩葉片上則不能,這表明V.dahliae毒素導(dǎo)致的細(xì)胞壞死也與葉片的年齡有關(guān)。這與V.dahliae導(dǎo)致的葉片萎焉壞死癥狀是從植株底部的老葉片開(kāi)始往頂端嫩葉片擴(kuò)展的病理癥狀是一致的。
　　 4.弱致病V.dahliae侵染棉花后,棉花根部組織的表達(dá)譜分析
　　 弱致病V.Dahliae菌株侵染棉花后,并不能導(dǎo)致棉

12、花產(chǎn)生明顯的病理癥狀,然而通過(guò)PCR能夠檢測(cè)到V.dahliae已經(jīng)進(jìn)入棉花幼苗的根與莖中。在表達(dá)譜分析前,基于Solexa測(cè)序技術(shù)對(duì)RNA樣本質(zhì)量的要求,而實(shí)驗(yàn)室已有的實(shí)驗(yàn)方法提取的棉花根部組織RNA并不能滿足要求,因此通過(guò)比較幾種提取方法,我們選擇并優(yōu)化了一種質(zhì)量可靠的棉花根部組織RNA提取方法。
　　 提取V.dahliae侵染72 h后棉花根部組織的RNA樣品,通過(guò)Solexa測(cè)序,以對(duì)照組(Control)樣品得到的基

13、因表達(dá)豐度信息為對(duì)照,分析實(shí)驗(yàn)組(Treatment)樣品基因的相對(duì)表達(dá)豐度,共有2681個(gè)表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的差異基因,其中包含1017個(gè)上調(diào)表達(dá)基因與1664個(gè)下調(diào)表達(dá)基因。
　　 對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG Pathway顯著性富集分析后發(fā)現(xiàn)。這些差異表達(dá)基因包含在4條上調(diào)表達(dá)通路與3條下調(diào)表達(dá)通路中。這些上調(diào)表達(dá)通路包括:1),黃酮(Flavone)與黃酮醇(Flavonol)代謝通路;2),類黃酮類物質(zhì)(Flavonoid

14、)代謝通路;3),外芪類化合物(Stilbenoid),二芳基庚醇(Diarylheptanoid)及姜辣素(Cringerol)合成代謝途徑,這幾條通路的產(chǎn)物已經(jīng)被證明具有抗氧化、抗微生物的性質(zhì);4),細(xì)胞色素P450單加氧酶外源物質(zhì)代謝(Metabolism of xenobiotics)通路,該通路參與代謝細(xì)胞外有毒物質(zhì)。下調(diào)表達(dá)通路包括:1),核糖體(Ribosome)相關(guān)通路;2),剪切體(Spliceosome)相關(guān)通路,S

15、pliceosome與Ribosome分別參與基因的表達(dá)與蛋白翻譯過(guò)程,這兩個(gè)通路相關(guān)基因的下調(diào)表達(dá)表明,在V.dahliae的侵染下,植物本身的正常生理功能可能已被破壞,這個(gè)結(jié)論與棉花被弱致病菌侵染后表現(xiàn)的癥狀一致(棉花側(cè)根嚴(yán)重壞死);3),甾族化合物(Steroid)代謝通路,該通路代謝產(chǎn)物能促進(jìn)植物組織分化及生長(zhǎng),然而Steroid通路與病原菌互作的相關(guān)報(bào)道很少,因此我們使用Realtime-PCR驗(yàn)證該通路中一些基因的表達(dá)變化,