茶樹花青素還原酶基因的原核表達(dá).pdf

1、兒茶素是茶樹重要次生代謝產(chǎn)物茶多酚的主體組分，也是決定茶葉品質(zhì)的主要化學(xué)成分，研究茶兒茶素合成途徑中關(guān)鍵基因的功能，對茶樹良種選育、茶葉品質(zhì)調(diào)控具有重要意義。
　　 兒茶素合成途徑基本探明，其中花青素還原酶（ANR）是兒茶素EC和EGC合成直接相關(guān)的酶類，本實驗利用RT-PCR、原核表達(dá)、HPLC技術(shù)，對GeneBank登錄的兩條茶樹ANR基因進(jìn)行了克隆、目的蛋白的原核表達(dá)、蛋白酶活性檢測、反應(yīng)產(chǎn)物鑒定等；并對目的蛋白在原核表達(dá)

2、中的誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑IPTG濃度、氨芐青霉素濃度進(jìn)行了優(yōu)化。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1.通過RT-PCR技術(shù)克隆了CsANR1和CsANR2的ORF序列，使用DNAMAN軟件、SignalP3.0軟件、SOPMA軟件、SWISS-MODEL網(wǎng)站軟件，對兩個基因的序列進(jìn)行了比對，預(yù)測了信號肽序列，模擬了蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示：CsANR1和CsANR2兩個基因的氨基酸序列一致性為79％；CsA

3、NR1其N段34個氨基酸為信號肽序列，CsANR2其N端44個氨基酸為信號肽序列，去除信號肽之后兩個基因的氨基酸序列一致性為83％；CsANR1和CsANR2蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)元件數(shù)量和分布非常相似，模擬的三級結(jié)構(gòu)也非常相似。蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)推測CsANR1和CsANR2具有相似的功能，但信號肽差異推測兩種蛋白的亞細(xì)胞定位有差異。
　　 2．利用構(gòu)建的pET-ANR1和pET-ANR2重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化了表達(dá)宿主菌rosetta(DE3)

4、，并用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，通過對誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)IPTG濃度、氨芐青霉素濃度進(jìn)行優(yōu)化，確立以25℃為誘導(dǎo)溫度，1.0mmol/L作為誘導(dǎo)IPTG濃度，200μg/mL作為誘導(dǎo)氨芐青霉素濃度，誘導(dǎo)5h為最佳誘導(dǎo)條件。
　　 3.使用親和樹脂對誘導(dǎo)產(chǎn)生的融合蛋白進(jìn)行純化，以CYA為底物，NADPH為輔酶，對CsANR1和CsANR2融合蛋白活性進(jìn)行檢測，通過HPLC分析酶促反應(yīng)產(chǎn)物。
　　 結(jié)果顯示，CsANR