茶樹中花青素還原酶的研究.pdf

1、兒茶素類是茶多酚的主體組分，是茶葉最重要的特征代謝成分，同時(shí)也是構(gòu)成茶葉品質(zhì)的主要化學(xué)成分。
　　 在兒茶素合成途徑中涉及到很多酶類，主要有苯丙氨酸脫氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL、肉桂酸羧化酶（cinnamate4-hydroxylase，C4H）、4-香豆酰CoA連接酶（4-coumaroyl-CoA ligase，4CL）、查耳酮合成酶（chalcone synthase，CHS）、：查

2、耳酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase，CHI）、二氫黃酮3-羥化酶（（2S）-flavanone3-hydroxylase，F(xiàn)3H）；黃烷酮3’-羥化酶（flavonoid3’-hydroxylase，F(xiàn)3'H）、黃烷酮3’，5’-羥化酶（flavonoid3’，5’-hydroxylase，F(xiàn)3’5’H）、二氫黃烷醇4-還原酶（dihydroflavonol4-reductase，DFR）、無色花色素還原酶（leucoan

3、thocyanidin reductase，LAR）、花青素合成酶（anthocyanidin synthase，ANS）、花青素還原酶（anthocyanidin reductase，ANR）、沒食子轉(zhuǎn)移酶（galloyl transferase）。其中ANR是與兒茶素EC和EGC合成直接相關(guān)的酶類。本實(shí)驗(yàn)首先利用TLC、HPLC、分光光度法對(duì)茶葉中ANR反應(yīng)產(chǎn)物形成和輔酶消耗進(jìn)行了鑒定；建立了ANR酶活性的分光光度檢測方法，該方法具

4、有成本低、操作簡單的特點(diǎn)；從最適溫度、pH、酶蛋白、底物濃度的方面，對(duì)ANR反應(yīng)體系的檢測條件進(jìn)行了研究；研究了不同季節(jié)和茶樹不同部位鮮葉中兒茶素EC和EGC的含量與ANR活性間的相關(guān)性；對(duì)EC、EGC、C、GC之間的異構(gòu)化與羥基化做了初步的研究。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1.利用高效液相色譜（HPLC）、薄層層析（TLC）、分光光度法分別對(duì)ANR酶促反應(yīng)的產(chǎn)物兒茶素EC和EGC的形成和輔酶NADPH消耗進(jìn)行鑒定

5、。
　　 2.建立了以輔酶NADPH消耗為基礎(chǔ)的ANR活性的分光光度檢測方法，并對(duì)影響ANR活性檢測體系的條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，1.5毫升ANR反應(yīng)體系中包括0.0625mmol/L，CYA或DEL，0.5mmol/L Vc，1mmol/L NADPH和0.1 mol/L pH6.5磷酸緩沖液和酶提取液若干（含150微克蛋白），于45℃反應(yīng)20min，用紫外分光光度計(jì)記錄340nm處吸光度的變化。該方法的建立為進(jìn)一步分離純化

6、酶蛋白打下良好的基礎(chǔ)。
　　 3.對(duì)不同季節(jié)、茶樹不同部位鮮葉中的兒茶素組分、DFR/LAR和ANR活性進(jìn)行了測定，結(jié)果表明，在春，夏，秋三個(gè)季節(jié)，鮮葉中ANRCYA的活性均高于ANRDEL，ANRCYA和ANRDEL的活性在三葉中最高，EC與EGC在鮮葉中的含量與ANR活性相關(guān)性并不大；鮮葉中DFR/LARDHM的活性高于DFR/LARDHQ，茶葉幼嫩程度越高，DFR/LAR活性也越高，DFR/LAR活性變化與兒茶素GC的變化