1，3-丙二醇氧化還原酶和醛還原酶基因的克隆與表達(dá).pdf

1、1,3-丙二醇具有廣泛的應(yīng)用，特別是在聚酯合成工業(yè)上。微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)1,3-丙二醇與化學(xué)法相比，具有明顯的優(yōu)點。近年來，微生物轉(zhuǎn)化法越來越受到人們的重視。 甘油歧化的氧化途徑提供的NADH的量是有限的，從而限制了1,3-丙二醇的合成。代謝流分析表明，如果1,3-丙二醇氧化還原酶既能利用NADH，又能利用NADPH，將會增加1,3-丙二醇的產(chǎn)量。根據(jù)計算機(jī)模擬的結(jié)果，通過定點突變的方法將Asp41突變?yōu)楦拾彼?，來改變該酶結(jié)合輔

2、酶的特異性。酶活測定結(jié)果顯示，突變酶分別以NADH和NADPH為輔酶時比酶活分別為629.38U/mg和277.35U/mg，而原始酶分別為706.90U/mg和20.95U/mg。原始酶對NADH的米氏常數(shù)(Km)和轉(zhuǎn)換數(shù)(kcat)分別為0.015mmol/L和90.641/s。突變酶對NADH的Km和kcat分別為0.48mmol/L和411.611/s，對NADPH的Km和kcat分別為0.14mmol/L和187.351/s。

3、雖然突變酶利用兩種輔酶的Km都有所增加，但是利用NADH的kcat比原始酶提高3.54倍，利用NADPH的kcat比原始酶提高1.07倍。 以Klebsiella pneumoniae DSM2026基因組為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到醛還原酶的基因yqhD，將其連接到表達(dá)載體pET23a(+)上，重組質(zhì)粒在E.coliBL21(DE3)中得到了高效表達(dá)。經(jīng)過Q-Sepharose和SephacrylS-300兩步柱層析純化后

4、，得到電泳條帶單一的純酶。以3-羥基丙醛為底物，測得該酶的比活力為3.8U/mg，而以1,3-丙二醇為底物時，檢測不到酶活力。該酶的最適pH為5.8，最適溫度為60℃。該酶可利用多種底物，對丁醛的酶活力最高，其次是3-羥基丙醛。該酶對NADPH和NADH的Km值分別為0.07mmol/L和1.42mmol/L，表明它依賴輔酶的靈活性。 在前期工作的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了三個重組質(zhì)粒pDK6-dhaT，pDK6-dhaT’和pDK6-y