家蠶精氨酸激酶的功能初步研究.pdf

1、精氨酸激酶是一種廣泛存在于無(wú)脊椎生物并在能量代謝中發(fā)揮重要作用的磷酸原激酶。目前,人們已經(jīng)鑒定了多種生物的精氨酸激酶基因,但是針對(duì)家蠶精氨酸激酶基因相關(guān)的報(bào)道還比較少。
　　 本研究通過(guò)生物信息學(xué)與實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法克隆到了家蠶精氨酸激酶基因,并對(duì)它結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了初步研究。主要結(jié)論如下:
　　 (1)從Genbank中搜索到家蠶BmAK基因(GenBank登錄號(hào):QD272299),并運(yùn)用相關(guān)的生物信息學(xué)軟件對(duì)其進(jìn)行了分

2、析,結(jié)果表明BmAK基因定位在家蠶第5號(hào)染色體上,其cDNA全長(zhǎng)為1268 bp,含有兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子,5’和3’非翻譯區(qū)分別為30和170 bp,開(kāi)放閱讀框(ORF)全長(zhǎng)為1068 bp,編碼355個(gè)氨基酸,相對(duì)分子量為40 kDa,等電點(diǎn)為5.87。BmAK蛋白在進(jìn)化上非常保守,通過(guò)多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)它與其他9個(gè)物種的AK序列相似度較高。
　　 (2)根據(jù)序列設(shè)計(jì)特異性引物,采用PCR技術(shù)擴(kuò)增BrnAK全長(zhǎng)基因,采用pE

3、T-28a(+)載體在大腸桿菌Rosetta中進(jìn)行了融合表達(dá),且得到了可溶性蛋白。利用Ni-TNA柱通過(guò)親和層析法純化出有活性的蛋白質(zhì),通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)和Western blotting實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了質(zhì)粒pET28a(+)-BmAK在大腸桿菌Rosetta中表達(dá)的重組蛋白為His-BmAK融合蛋白。同時(shí)酶活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)證明該重組蛋白具有消耗ATP,即轉(zhuǎn)運(yùn)高能磷酸基團(tuán)的能力。通過(guò)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該基因主要定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞質(zhì)的某些組織上。

4、
　　 (3)RT-PCR結(jié)果顯示該基因在家蠶各組織和各發(fā)育階段都有表達(dá),但在血淋巴、卵巢、精巢中的表達(dá)量較低,在脂肪體中的表達(dá)量較高；除在二齡和三齡家蠶中的表達(dá)量較低外,其余各發(fā)育階段都有表達(dá),尤其在五齡的表達(dá)量最高。利用抗核型多角體病毒家蠶品系NB、敏感性品系306和用它們構(gòu)建的近等基因系BC8研究了AK在家蠶抗核型多角體病毒病中所發(fā)揮的作用。我們對(duì)這些家蠶品系添食病毒后24小時(shí)的中腸樣本進(jìn)行了熒光定量PCR檢測(cè),發(fā)現(xiàn)AK基